IP-RP-HPLC 法同时测定感冒清片中3 种成分

朱链链，王丽琼

（1.乐山职业技术学院，四川 乐山 614000；2.乐山市食品药品检验检测中心，四川 乐山 614000）

感冒清片属于抗感冒药类中西药复方制剂，由3 种西药（对乙酰氨基酚、盐酸吗啉胍、马来酸氯苯那敏）和6 种中药（南板蓝根、大青叶、金盏银盘、岗梅、山芝麻、穿心莲叶）制成，该类制剂应用广泛，但其不良反应问题也居高不下［1］，业界大多认为其原因是在临床使用时易忽略所含化学成分，关键项目（如有关物质、含有量均匀度、溶出度）缺失，故建议对该类药物进行再评价［2］。

文献［3-8］报道，采用HPLC 法测定对乙酰氨基酚、盐酸吗啉胍、马来酸氯苯那敏单一或多种成分含有量，但盐酸吗啉胍保留弱，易受溶剂峰干扰，而在流动相中加入离子对试剂可使分离变好。本实验建立离子对反相高效液相色谱（ion-pair reversephase high performance liquid chromatography，IP-RPHPLC）法同时测定感冒清片中对乙酰氨基酚、盐酸吗啉胍、马来酸氯苯那敏的含有量，并考察三者含有量均匀度，以期为该制剂质量标准提高提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪（配置四元泵、DAD 检测器）；XS205 电子天平、FE28 PH计（瑞士梅特勒-托利多公司）；CQ-100B 超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂）。

1.2 试剂与药物 对乙酰氨基酚（100018-201610，质量分数99.9%）、盐酸吗啉胍（100483-200402，质量分数100%）、马来酸氯苯那敏（100047-201507，质量分数99.7%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。感冒清片（广东一片天医药集团制药有限公司，批号171113、171208；广东南国药业有限公司，批号170606），每片含对乙酰氨基酚12 mg、盐酸吗啉胍12 mg、马来酸氯苯那敏0.5 mg。甲醇为色谱纯或分析纯；磷酸、磷酸二氢钾为分析纯；辛烷磺酸钠（离子对色谱试剂）；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters XTerraC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）-0.02 mol/L磷酸二氢钾（含0.005 mol/L 辛烷磺酸钠，10%磷酸调节pH 至3.0）（B），梯度洗脱（0～20 min，10%～75% A；20～21 min，75%～10% A；21～26 min，10% A）；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长215 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。由此可知，各成分分离度良好，理论塔板数按对乙酰氨基酚峰计为18 394，其他成分在三者保留时间上没有色谱峰，不干扰测定。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取对照品对乙酰氨基酚48.38 mg、盐酸吗啉胍47.74 mg，置于同一50 mL量瓶中，25%甲醇（pH=3.0）溶解；精密称取马来酸氯苯那敏对照品10.24 mg，置于10 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL，置于上述50 mL 量瓶中，溶剂稀释至刻度，作为贮备液。精密量取5 mL 于10 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取本品10 片，精密称定质量，计算平均片重，研细，取约0.22 g（相当于12 mg 对乙酰氨基酚），置于25 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）超声助溶，放冷，25%甲醇（pH=3）稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方比例分别制备不含对乙酰氨基酚、盐酸吗啉胍、马来酸氯苯那敏的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 定量限 精密称取对乙酰氨基酚、盐酸吗啉胍、马来酸氯苯那敏对照品适量，25%甲醇（pH=3）溶解并分别稀释成0.32、0.05、0.51 μg/mL，在“2.1”项色谱条件下进样测定。结果，三者信噪比（S/N）分别为37.2、43.8、46.8（以氯苯那敏峰计）；以S/N=10，得定量限分别为0.09、0.01、0.11 μg/mL。

2.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液1、2、4、6、8 mL，置于10 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）稀释至刻度，摇匀，得线标溶液，取其与对照品溶液共6 份，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 精密量取“2.2.2”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得对乙酰氨基酚、盐酸吗啉胍、马来酸氯苯那敏峰面积RSD 分别为0.2%、0.2%、0.4%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批本品（批号171113），按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得对乙酰氨基酚、盐酸吗啉胍、马来酸氯苯那敏（以氯苯那敏计）含有量RSD 分别为1.2%，1.0%、1.3%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 精密量取“2.2.2”项下供试品溶液，室温下于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得对乙酰氨基酚、盐酸吗啉胍、氯苯那敏峰面积RSD 分别为0.4%，0.6%、1.1%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取含有量已知的本品6 份（批号171113），每份约0.11 g，置于6 个25 mL 量瓶中；精密称取对照品对乙酰氨基酚60.21 mg、盐酸吗啉胍60.02 mg，置同一10 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）溶解并稀释至刻度，精密量取1 mL，置于上述25 mL 量瓶中；精密称取马来酸氯苯那敏对照品12.51 mg，置于50 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）溶解并稀释至刻度，精密量 取1 mL，置于上 述25 mL 量瓶中，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.9 样品含有量测定 精密称取本品3 批，每批3 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，外标法计算含有量，结果见表3。

表3 各成分含有量测定结果（n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（n＝3）

2.10 含有量均匀度测定 取本品3 批，每批10份，置于25 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）超声助溶，放冷，25%甲醇（pH=3）稀释至刻度，摇匀，各精密量取10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，外标法计算含有量。然后，根据2015年版《中国药典》 四部方法［9］，计算A［标示量（100）与含有量平均值之差的绝对值］+2.2S（含有量标准差），结果见表4，发现均符合药典规定［A+2.2S＜L（L以15.0 计）］。

表4 各成分含有量均匀度测定结果Tab.4 Results of content uniformity determination of various constituents

3 讨论

3.1 检测波长选择 马来酸氯苯那敏最大吸收波长为262 nm，但供试品溶液中其质量浓度较低，故考虑215 nm，同时在该处对乙酰氨基酚有波谷，盐酸吗啉胍有波峰。最终，确定215 nm 作为检测波长［10］。

3.2 流动相选择

3.2.1 离子对试剂种类与浓度 本实验考察了戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠，发现离子对试剂烷基链越长，盐酸吗啉胍保留时间越长，与相邻的对乙酰氨基酚色谱峰分离度越高［11-12］，而且其浓度对色谱峰保留也有很大影响［13］，故又对此进行考察。结果显示，随着离子对试剂浓度的升高，盐酸吗啉胍峰保留时间延长，峰型由不对称逐渐优化为对称，当辛烷磺酸钠浓度高于0.005 mol/L 时，分离度合适，峰形良好。同时，考虑到离子对试剂浓度过大时对仪器和色谱柱均有不利影响，故最终选择0.005 mol/L 辛烷磺酸钠，可使盐酸吗啉胍在色谱柱上有较好的保留，并与其他成分的分离度理想，互不干扰。

3.2.2 缓冲液 本实验考察了缓冲盐对成分分析的影响，发现基线在无磷酸盐的流动相中不平稳，峰形不对称；添加磷酸二氢钾后基线平稳，而且由于离子强度的改变，盐酸吗啉胍色谱峰保留时间提前，故选择0.02 mol/L 磷酸二氢钾作为缓冲液。

3.2.3 流动相pH 本实验考察了2.0、3.0、4.0、4.5，发现随着pH 降低盐酸吗啉胍保留时间延长，同时峰形高而尖锐，考虑到C18色谱柱对pH 值的耐受范围为2～8，故最终选择3.0 作为流动相pH。

3.3 柱温选择 柱温对离子对色谱的影响较大［14］。本实验考察了20、25、30、35、40 ℃，发现柱温越高，各组分出峰越快，但过高时氯苯那敏色谱峰受干扰较大，峰形较差。最终，选择30 ℃作为柱温，此时出峰时间适中，峰形理想。