厚朴乙醇提取物固体分散体的制备

王 潇，王 婷，成颜芬，何 单，刘 芳，傅超美

（成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137）

厚朴始载于《神农本草经》，具有燥湿消痰、下气除满的功效［1-3］，其主要成分为木脂素、生物碱、挥发油等，具有缓解胃肠运动障碍、抗抑郁、抗菌、抗炎等药理作用［4］，常与其他药物合用，临床使用广泛，如《伤寒杂病论》 中的小承气汤、半夏厚朴汤等［4］。厚朴传统入药形式为水煎液，随着对其研究的不断深入，提取方式也日益完善，在2015 年版《中国药典》 中，有9 种中成药都是以不同体积分数乙醇提取，在一定程度上提高了其有效成分提取率，但厚朴酚、和厚朴酚等主要有效成分难溶于水，其口服生物利用度仍然较低，从而限制了相关制剂开发，影响了临床应用［5-6］。

针对药物难溶性的问题，目前大多制备微乳、纳米粒、脂质体、固体分散体等剂型加以改善［7-8］，同时，中药提取物多成分同时增溶是制剂领域的一大难题，将提取物制成固体分散体［9］后可实现这一点。前期报道，将厚朴酚、和厚朴酚、厚朴总酚制成固体分散体［10-12］可提高厚朴主要有效成分溶解性。本实验制备厚朴乙醇提取物固体分散体［13］，通过Box-Behnken 响应面法优化其制备工艺，并进行体外表征，以期解决提取物多成分同时增溶的难题，为相关制剂开发提供参考。

1 材料

1.1 仪器 电子天平（上海花潮电器有限公司）；ZDHW 调温电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；DZF-6050 台式真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；UPK-I-107 优普系列超纯水器（四川优普超纯科技有限公司）；LC-2030C 高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；电子天平［十万分之一，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；UV756CRT 紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）。

1.2 试剂与药物 厚朴采自四川省都江堰虹口镇，经成都中医药大学标本中心连艳老师鉴定为木兰科植物厚朴Magnolia officinalisRehd.et Wils。厚朴酚（批号A0316AS，纯度＞98%）、和厚朴酚（批号S0318AS，纯度＞98%）对照品（大连美仑生物技术有限公司）。聚乙二醇6000（PEG6000）、羟丙基甲基纤维素（HPMC）（成都科龙化工试剂厂）；泊洛沙姆188（F68，德国BASF 公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP，天津市欧博凯化工有限公司）。

2 方法与结果

2.1 提取物制备 根据课题组前期所得最佳提取工艺，饮片粉碎成粗粉，称取约1 kg，8 倍量70%乙醇回流提取2 次，每次1.5 h，合并提取液，50 ℃下减压浓缩至无醇味，提取液冷冻干燥，粉碎，即得。

2.2 厚朴酚、和厚朴酚含有量测定

2.2.1 对照品溶液制备 分别精密称取厚朴酚、和厚朴酚对照品10.10、10.72 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇超声溶解后稀释至刻度，各取25 mL 于50 mL 量瓶中混合，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 取提取物约100 mg，精密称定，置于100 mL 量瓶中，甲醇超声溶解后稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 色谱条件 参考2015 年版《中国药典》，分析采用Agilent 5 TC-C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.1% 磷酸（78∶22）；体积流量1.0 mL/min；检测波长294 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下对照品溶液5 mL，甲醇倍比稀释至厚朴酚质量浓度分别为3.16、6.31、12.63、25.25、50.50、101.00 μg/mL，和厚朴酚质量浓度分别为3.35、6.70、13.40、26.80、53.60、107.20 μg/mL，摇匀，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程分别为厚朴酚Y=15 915 320X+33 591（r=0.999 5），线性范围3.16～101.00 μg/mL；和厚朴酚Y=16 793 512X+47 215（r=0.999 1），线性范围3.35～107.20 μg/mL。表明各成分在各自范围内线性关系良好。

2.2.4.2 精密度试验 精密量取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定6 次，测得厚朴酚、和厚朴酚峰面积RSD 分别为0.28%、0.34%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.3 稳定性试验 精密量取“2.2.2”项下供试品溶液，分别于0、3、6、12、24、48 h 在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，测得厚朴酚、和厚朴酚峰面积RSD 分别为0.42%、0.34%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.2.4.4 重复性试验 取提取物适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，测得厚朴酚、和厚朴酚含有量RSD 分别为1.32%、1.53%，表明该方法重复性良好。

2.2.4.5 加样回收率试验 精密称取6 份含有量已知的提取物，精密加入对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，厚朴酚、和厚朴酚平均加样回收率分别为98.47%（RSD=1.92%），99.69%（RSD=2.31%）。

2.2.5 测定结果 厚朴酚、和厚朴酚平均含有量（n=3）分别为（18.54 ± 0.18）%、（10.53 ±0.79）%。

2.3 固体分散体制备［5］采用溶剂法、PEG6000-F68 联合载体制备，溶出介质为人工肠液。取厚朴提取物适量，与载体按一定比例混合均匀后用适量乙醇溶解，置于磁力搅拌器上搅拌适当时间，旋蒸除去乙醇后置于真空干燥箱中24 h，取出，粉碎，过40 目筛，即得，置于干燥器中备用。

2.4 体外溶出度测定 将约含1 g 厚朴提取物的固体分散体直接投入溶出杯中，按照2015 年版《中国药典》 四部通则0931 第二法（桨法）［3］测定溶出度，溶出介质900 mL 人工肠液，转速50 r/min，溶出液温度（37±0.5）℃。分别于5、10、15、20、30、45、60、120 min 各取5 mL，补加同温同体积溶出介质，取出液加同体积甲醇，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，计算厚朴酚、和厚朴酚总溶出率，绘制溶出度曲线。

2.5 工艺考察

2.5.1 制备方法 固定药载比为1∶5，载体为F68，分别采用下列方法制备。（1）溶剂法，同“2.3”项；（2）熔融法，将载体置于蒸发皿中，70 ℃水浴锅上使其熔融后加入适量厚朴提取物，水浴锅上继续搅拌均匀，室温下冷却变脆后粉碎；（3）溶剂-熔融法，将载体置于蒸发皿中，70 ℃水浴锅上使其熔融后加入适量乙醇溶解的厚朴提取物，搅拌除去乙醇，室温下冷却，置于真空干燥箱中干燥后粉碎；（4）研磨法，将厚朴提取物和载体置于研钵中，用力研磨至颜色均匀，按“2.4”项下方法测定上述固体分散体溶出度，结果见图2A，由此可知，120 min 内累积溶出度依次为溶剂法＞熔融法＞溶剂-熔融法＞研磨法，故选择溶剂法进行制备［14］。

图2 制备方法、溶出介质、载体种类对总溶出度的影响Fig.2 Effects of preparation method，dissolution medium and carrier kind on total dissolution rate

2.5.2 溶出介质 固定药载比为1∶5，载体为F68，按“2.3”项下方法制备固体分散体，按“2.4”项下方法分别测定其在人工胃液、人工肠液、纯水中的溶出度，结果见图2B。由此可知，120 min 内累积溶出度依次为人工肠液＞纯水＞人工胃液，故选择人工肠液作为溶出介质。

2.5.3 载体种类 固定药载比为1∶5，选择PEG6000、F68、HPMC、PVP K30 作为载体，按“2.3”项下方法制备固体分散体，按“2.4”项下方法测定溶出度，结果见图2C。由此可知，120 min内累积溶出度依次为PEG6000 大于F68 大于PVP K30 大于HPMC，故选择PEG6000-F68（1∶1）作为载体，并可避免单一载体造成的老化问题［15］。

2.6 单因素试验 考察了载体（PEG6000-F68）比、药载比、搅拌时间、乙醇体积分数，考察四者对60 min 内厚朴酚、和厚朴酚总溶出度的影响，结果见图3。由此可知，乙醇体积分数为90%时总溶出度最高，故固定溶剂为90% 乙醇，不作后续优化。

图3 载体比、药载比、搅拌时间、乙醇体积分数对总溶出度的影响Fig.3 Effects of carrier ratio，drug-carrier ratio，stirring time and ethanol concentration on total dissolution rate

2.7 Box-Behnken 响应面法优化 在单因素试验基础上，选择载体比（A）、药载比（B）、搅拌时间（C）作为影响因素，总溶出度（Y）作为评价指标来优化制备工艺，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

通过Design-Expert 10.0.7 软件对表2 数据进行处理，得到拟合回归方程为Y=96.89-4.10A+4.46B-2.94C-7.41AB+0.52AC-0.21BC-9.51A2-17.17B2-14.57C2，方差分析见表3。由表可知，模型P＜0.01，表明其极显著；失拟项P＞0.05，表明模型拟合度良好；一次项中，A、B均为显著项（P＜0.05），C为不显著项（P＞0.05），程度依次为B＞A＞C；二次项中，A2、B2、C2均有显著影响（P＜0.05）；交互项中，AB为显著项（P＜0.05），AC、BC均为不显著项（P＞0.05）；调整系数为0.914 3，即能解释91.43%响应值的变化，表明模型拟合程度高，试验误差小。响应面分析见图4。

由此可知，最优制备工艺为载体比0.885∶1，药载比1∶5.388，搅拌时间116.775 min，考虑到实际可操作性，将其修正为载体比0.9∶1，药载比1∶5.4，搅拌时间115 min。按该优化工艺进行3 批验证试验，测得平均溶出度为97.12%，RSD为1.77%，与预测值98.08%接近，表明模型稳定可靠，工艺合理可行。

图4 各因素响应面图Fig.4 Response surface plots for various factors

2.8 体外表征

2.8.1 体外溶出度 精密称取厚朴提取物、厚朴物理混合物、厚朴固体分散体适量，按“2.4”项下方法测定总溶出度，结果见图5，可知厚朴固体分散体能提高有效成分溶出度。

2.8.2 扫描电镜（SEM）图6 显示，提取物呈块状物，表面光滑或有细密小孔；载体为颗粒形，表面有明显孔隙；药物-载体物理混合物可见药物块状物，载体颗粒物更小，颗粒剂也有孔隙存在；固体分散体呈无定形态，完全看不到孔隙，推测药物可能已高度分散于载体中，表明制备成功。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

图5 厚朴各样品溶出曲线Fig.5 Dissolution curves for various samples of M.officinalis

图6 厚朴各样品SEM 图Fig.6 SEM images for various samples of M.officinalis

2.8.3 差示量热扫描（DSC）以空铝坩为参考池，另一空铝坩为样品池，放入约10 mg 样品，扫描速度10 ℃/min，扫描范围35～200 ℃，结果见图7。由此可知，提取物在60 ℃左右有明显吸热峰；载体在40～50 ℃有2 个吸热峰，吸热峰较大；药物-载体物理混合物在40～50 ℃也有2 个吸热峰，但均较小；固体分散体吸热峰消失，表明其以无定型状态存在，并且制备成功。

图7 厚朴各样品DSC 图Fig.7 DSC diagrams for various samples of M.officinalis

2.8.4 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）KBr 压片，扫描范围4 000～400 cm-1，结果见图8。由此可知，提取物在3 381 cm-1有1 个强而宽的吸收峰，表明有-OH 存在；载体仅在3 485 cm-1处有1个小吸收峰，与提取物明显不同；药物-载体物理混合物中同时具有药物、载体特征吸收峰，表明两者之间未形成新化合键；固体分散体在3 416 cm-1处形成了1 个新吸收峰，表明在制备过程中发生了化学反应，可能药物中-OH 在载体材料中形成分子内氢键，从而对其吸收峰位置、形状、强度均产生一定影响。

图8 厚朴各样品FT-IR 图谱Fig.8 FT-IR spectra for various samples of M.officinalis

3 讨论

厚朴乙醇提取物组成复杂，含有木脂素（如厚朴酚、和厚朴酚）、生物碱（如木兰花碱）等成分，以厚朴酚、和厚朴酚为主，但两者水溶性差，体外溶出度低［16］，故本实验以其总溶出度为评价指标，采用Box-Behnken 响应面法优化［17］制备工艺，并进行体外表征。结果表明，工艺稳定可行。

在用PEG 6000、F68、HPMC、聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30）等几种水溶性材料制备固体分散体时，载体强大的增溶效果，可使药物处于过饱和状态，并且后者在载体中的分散度大大提高［13］，使其以分子形式不规则地分散在载体中，从而形成无定形固体分散体［18-20］。本实验选择PEG 6000、F68联合载体，有利于同时增加厚朴乙醇提取物多成分溶出度，提高其生物利用度。

固体分散体在储存过程中，环境中的水分会竞争性地与药物或载体结合，破坏药物与载体之间的氢键相互作用，出现不稳定这一“老化”问题［21］。今后，将针对厚朴乙醇提取物固体分散体的稳定性、生物利用度进行深入研究。