川芎-天麻配伍对川芎中2 种成分在大鼠脑内药动学的影响

米雅慧，郭思宇，刘明平，韦品清，程 欢，柯国韩

（广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006）

偏头痛是一种搏动性中度或重度原发性头痛，通常单侧发生［1］，影响至少15%的一般人群［2］，中医药治疗该疾病时表现出良好的疗效。天麻丸收载于《御药院方》，由川芎、天麻2 味药材组成，主治首风旋晕弦急、偏正头疼、外合阳气、风寒相搏、胃膈痰饮、身体拘倦［3］，方中川芎及其主要化合物具有增加冠状动脉血流量、改善微循环、抗血小板聚集、镇静、神经保护等作用［4-5］，而天麻功效镇痛、镇静、抗氧化等［6］。川芎嗪、阿魏酸是前者代表性活性成分，而天麻素、天麻苷元是后者主要有效成分，两者配伍是治疗偏头痛的常用药对［7］。课题组前期进行了川芎-天麻不同配比对血瘀型偏头痛大鼠的药效学分析及体内药动学研究，本实验在此基础上，探讨其对川芎中川芎嗪、阿魏酸在血瘀偏头痛大鼠脑内药动学影响，以期揭示古方配伍的科学内涵。

1 材料

微透析系统，配置MD-1001 推进器、MD-1000单注射泵控制器、MDN-0100 气密性注射器（1 mL）、MF-5164 连接管、MD-1002 三注射器支架、MD-2310 脉管探针、MD-1510 接头（美国BASI 公司）；Surveyor 超高效液相色谱仪，配置Xcalibur 2.0 工作站、TSQ QUANTUM AC-CESS 三级四极杆质谱仪（美国Thermo Fisher 公司）；Kinetex C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；XR205SM-DR 型分析天平（瑞士Precisa 公司）。

盐酸川芎嗪、阿魏酸（批号110817-201006、110773-201313）对照品购自中国食品药品检定研究院；川芎嗪、阿魏酸（批号150615，质量分数88%、85%）及天麻苷元、天麻素（批号150515，质量分数86%、89%）对照品均购自成都克洛玛生物科技有限公司。乙腈、甲醇均为色谱纯，分别购自美国CNW 公司、德国Merck 公司；甲酸为分析纯，购自美国Sigma 公司。SPF 级雄性SD 大鼠18 只，体质量（200±20）g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（粤）2013-0020。

2 方法

2.1 对照品、内标溶液制备 精密称取对照品川芎嗪3 mg、阿魏酸2 mg，分别加入格林氏液、人工脑脊液，定容至100 mL，作为母液，再分别精密称取两者3、2 mg，置于100 mL 量瓶中，超纯水定容至刻度，得对照品溶液。精密吸取新诺明1 mL，加入林格氏液和人工脑脊液，定容至100 mL，得内标溶液。

2.2 川芎嗪、阿魏酸含有量测定

2.2.1 质谱条件 喷雾电压，正离子模式4 500 V，负离子模式-4 500 V；大气压电喷雾离子源，温度450 ℃；正离子检测电压46 eV，负离子检测电压32 eV；川芎嗪正离子模式检测，m/z137.1～80.05；阿魏酸负 离子模 式检测，m/z193.1～134.2。质谱图见图1。

图1 各成分二级质谱图Fig.1 Secondary mass spectrograms of various constituents

2.2.2 色谱条件 Kinetex C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流动相乙腈（A）-0.005% 甲酸（B），梯度洗脱（0～5 min，20% A，80% B；5～10 min，20%～90% A，80%～10% B；5.1～10 min，20%A，80% B）；体积流量0.3 mL/min；柱温25 ℃；进样量2 μL；托盘温度4 ℃。

2.2.3 专属性考察 将空白透析液、对照品溶液、给药后平衡0.5 h 透析液在“2.2.1”和“2.2.2”项条件下进样测定，结果见图2。由此可知，空白透析液基线平稳，对照品溶液、透析液中阿魏酸峰形良好，与内标互不干扰；脑组织透析液中川芎嗪、阿魏酸保留时间分别为1.67、2.03 min，表明该方法专属性良好。

图2 各成分UPLC 色谱图Fig.2 UPLC chromatograms of various constituents

2.2.4 线性关系考察 精密称取对照品盐酸川芎嗪6.06 mg（相当于川芎嗪5.08 mg）、阿魏酸4.11 mg，人工脑脊液定容于100 mL 量瓶中，将其倍比稀释后得到阿魏酸质量浓度分别为1 052.16、526.08、263.04、131.52、65.76、32.88、16.44、8.22、4.11、2.05 ng/mL，川芎嗪 质量浓 度分别 为1 300.48、650.24、325.12、162.56、81.28、40.64、20.32、10.16、5.08、2.54 ng/mL，作为对照品溶液，在“2.2.1”和“2.2.2”项条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程分别为川芎嗪Y=0.005 957X+0.038 16（R2=0.998 9），线性范围3.21～1 444.5 ng/mL；阿魏酸Y=0.004 25X+0.021 86（R2=0.999 5），线性范围5.47～2 461.5 ng/mL。表明各成分在各自范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 配制低、中、高质量浓度对照品溶液，在“2.2.1”和“2.2.2”项条件下进样测定6 次，测得川芎嗪日间精密度RSD 分别为1.93%、2.65%、2.94%，日内精密度RSD 分别为3.67%、2.17%、3.06%；阿魏酸前者RSD 分别为2.94%、3.42%、1.73%，后者RSD 分别为3.69%、2.81%、3.14%，表明该方法精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 配置低、中、高质量浓度对照品溶液，在“2.2.1”和“2.2.2”项条件下进样测定6 次，测得川芎嗪峰面积RSD 分别为4.32%、2.08%、2.75%，阿魏酸分别为2.78%、4.01%、3.62%。另外，样品在25 ℃（室温）、-80 ℃下保存30 d 及-80～25 ℃循环冻融条件下，川芎嗪峰面积RSD 分别为4.97%、2.54%、2.13%；3.06%、2.45%、2.67%；2.33%、2.21%、2.34%，而阿魏酸分别为2.12%、3.32%、2.64%；2.82%、3.49%、2.45%；2.55%、2.41%、1.98%，表明样品稳定性良好。

2.2.7 加样回收率试验 分别取川芎嗪（5.08 ng/mL）、阿魏 酸（4.11 ng/mL）对照品溶液 100、40、10 μL，加到空白人工脑脊液中，使其总体积为200 μL，在“2.2.1”和“2.2.2”项条件下进样测定，测得川芎嗪平均加样回收率分别为98.82%、101.64%、99.15%，RSD 分别为2.42%、3.12%、2.98%；阿魏酸平均加样回收率分别为101.21%、99.32%、100.52%，RSD 分别为2.42%、2.56%、3.31%。

2.2.8 体积流量对相对损失率的影响 空白、含药人工脑脊液及林格氏液在25 ℃下以不同体积流量灌流，探针置于其中，平衡后各收集6 份样品，UPLC-MS/MS 法测定接收样品质量浓度C透析和含药人工脑脊液中药物质量浓度C灌流，计算相对损失率，公式为相对损失率=［（C灌流-C透析）/C灌流］×100%。结果，人工脑脊液中川芎嗪、阿魏酸相对损失率 分别为 40.11%、36.50%、30.73%、28.99%、27.07%；39.58%、36.00%、33.19%、32.02%、29.52%，而林格氏液中两者相对损失率分别为41.02%、37.37%、32.85%、28.44%、24.91%；40.02%、37.57%、33.93%、30.28%、28.41%。

2.2.9 质量浓度对相对损失率的影响 将探针分别置于川芎嗪/阿魏酸质量浓度30/80、140/300、460/800、1 000/1 800 ng/mL 的含药、空白人工脑脊液和林格氏液中，25 ℃下以1.5 μL/min 体积流量灌流探针，平衡后各收集6 份样品，按“2.2.8”项下方法计算相对损失率。结果，人工脑脊液中川芎嗪和阿魏酸相对损失率分别为 36.54%、41.90%、37.92%、40.38% 和38.63%、36.73%、38.92%、34.50%，而林格氏液中两者相对损失率分别 为37.74%、38.42%、40.86%、42.27% 和41.06%、39.42%、38.93%、32.19%。

2.2.10 温度对相对损失率的影响 脑探针分别置于25、30、35、40 ℃下，将140、460 ng/mL 川芎嗪、阿魏酸含药、空白人工脑脊液和林格氏液以1.5 μL/min 体积流量灌流探针，平衡后各收集6份样品，按“2.2.8”项下方法计算相对损失率。结果，在不同温度下，人工脑脊液中川芎嗪和阿魏酸相对损失率分别为33.91%、33.46%、35.77%、39.28% 和32.31%、34.68%、36.85%、40.08%，而林格氏液中两者相对损失率分别为31.30%、36.20%、37.76%、41.58% 和27.31%、34.68%、36.85%、40.08%。

2.3 药动学研究

2.3.1 模型制备 大鼠随机分为川芎组、川芎-天麻（1∶0.25）组、川芎-天麻（1∶1）组，皮下注射0.8 mL/kg 盐酸肾上腺素，2 h 后置于0 ℃冰水中冷刺激5 min，2 h 后再注射盐酸肾上腺素，复制血瘀型偏头痛大鼠模型，然后禁食不禁水；另取大鼠，皮下注射硝酸甘油以复制偏头痛模型。

2.3.2 模型评估 大鼠从冰水中取出后，其表现为蜷缩少动，爪、尾部出现紫暗淤血，耳色暗红，喜扎堆、静处，呼吸减弱，被毛无光泽，畏寒喜暖等。激光多普勒血流仪检测发现其灌注量较正常大鼠显著降低，见图3；大鼠注射硝酸甘油后30 min，出现前肢频繁挠头、焦躁不安、爬笼次数增多的症状，表明模型复制成功［8］。

图3 激光多普勒血流仪检测大鼠结果Fig.3 Results of laser Doppler flowmeter detection of rats

2.3.3 探针植入 大鼠腹腔注射 20%（0.8 mL/100 g）乌拉坦麻醉，俯卧位固定于脑立体定位仪中，剔除头部被毛，分离大鼠头皮和脑外膜，暴露头骨，将脑探针固定于坐标AP+0.2 mm、MR +3.5 mm（人字交叉点为坐标中心）处，植入脑组织探针后，空白人工脑脊液以1.5 μL/min 体积流量灌流平衡［9-10］。

2.3.4 给药 将“2.3.1”项下各组大鼠分别灌胃给予川芎嗪5.25 mg/kg、阿魏酸63.75 mg/kg；川芎嗪5.25 mg/kg、阿魏酸63.75 mg/kg、天麻素183 mg/kg+天麻苷元24 mg/kg；川芎嗪5.25 mg/kg、阿魏酸63.75 mg/kg、天麻素45.75 mg/kg +天麻苷 元6 mg/kg，2 min 后开始接收样品以排除空白人工脑脊液的干扰。在预定时间点（川芎嗪5、10、20、40、60、…、480 min，阿魏酸5、10、20、40、…、240 min）接受透析液，-70 ℃冰箱中保存，UPLC-MS/MS 法测定川芎嗪、阿魏酸含有量。

2.3.5 数据分析 按公式相对损失率=［（C灌注-C透析）/C灌注］×100% 校正体内回收率，体内有效成分实际质量浓度（C实际）=测定值（C测）/相对损失率。通过PKSolver 软件［11］计算主要药动学参数，SPSS 23.0 软件［12］对其进行LSD 检验。

3 结果

3.1 川芎嗪血药浓度-时间曲线、药动学研究 图4、表1 显示，与单味药组比较，配伍组T1/2、MRT0～∞、Cmax、AUC0～∞升 高（P＜0.05，P＜0.01）；与川芎-天麻（1∶1）组比较，川芎-天麻（1∶0.25）组T1/2、MRT0～∞、AUC0～∞升高（P＜0.05，P＜0.01），Cmax降低（P＜0.05）。

3.2 阿魏酸血药浓度-时间曲线、药动学研究 图4、表2 显示，与单味药组比较，配伍组T1/2［川芎-天麻（1∶1）组差异无统计学意义（P＞0.05）］、MRT0～∞、Cmax、AUC0～∞升高（P＜0.05，P＜0.01）；与川芎-天麻（1∶1）组比较，川芎-天麻（1∶0.25）组T1/2、MRT0～∞、AUC0～∞升高（P＜0.01）。

4 讨论

川芎、天麻效应成分川芎嗪、阿魏酸在脑组织中的药动拟合情况根据拟合优度R2、AIC 等指标确定最佳房室模型，发现两者在血液、脑组织中均符合一室模型。根据拟合结果的药动学参数可知，配伍天麻后川芎嗪、阿魏酸Tmax延长，Cmax升高，MRT 减慢，AUC0～∞延长，吸收程度增加；与川芎-天麻（1∶1）组比较，川芎-天麻（1∶0.25）组MRT 进一步减慢，AUC0～∞进一步延长，表明天麻可促进两者透过血脑屏障、到达脑组织来发挥治疗偏头痛的作用，其原因可能为它可使血脑屏障通透性降低，增加两者脑内生物利用度和滞留时间，并延缓了脑内消除速率。

图4 大鼠血浆中各成分血药浓度-时间曲线Fig.4 Blood concentration-time curves for various constituents in rat plasma

表1 大鼠血浆中川芎嗪主要药动学参数（）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for tetramethylpyrazine in rat plasma（）

表1 大鼠血浆中川芎嗪主要药动学参数（）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for tetramethylpyrazine in rat plasma（）

注：与川芎单味药比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与川芎-天麻（1∶1）比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

表2 大鼠血浆中阿魏酸主要药动学参数（）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for ferulic acid in rat plasma（）

表2 大鼠血浆中阿魏酸主要药动学参数（）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for ferulic acid in rat plasma（）

注：与川芎单味药比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与川芎-天麻（1∶1）比较，△△P＜0.01。

同时还发现，川芎-天麻比例1∶0.25 时生物利用度最大，而1∶1 时脑组织Cmax最高，这可能与天麻素可提高血流速度变化指数［13］、加快川芎效应成分透过血脑屏障速度、增加脑组织中川芎嗪和阿魏酸蓄积量有关。