文冠果叶总黄酮微波辅助酶提取工艺的优化及其抗氧化、抑菌活性

王慧芳，赵飞燕，刘勇军，赵润柱，王 曼，姚 英，张恒慧

（1.太原工业学院化学与化工系，山西 太原 030008；2.浑源一中化学组，山西 大同 037400；3.太原工业学院环境与安全工程系，山西 太原 030008）

黄酮又称黄碱素，是一种以2-苯基色原酮为基本结构的化合物，常在植物体内与糖结合成苷［1］，大多数植物都含有此类化合物，具有调节动物激素、防治心血管疾病、提高机体免疫力、促进机体健康等功效［2-3］，关于其抗氧化、抑菌活性的报道也很多［4-6］。课题组前期采用HP-20 型大孔树脂对提取得到的陈皮黄酮进行分离提纯后，测定它对3 种革兰氏菌的抑制作用，发现对大肠杆菌的效果最佳［7］。

文冠果Xanthoceras sorbifoliaBunge 为无患子科文冠果属木本落叶小乔木或灌木，原产于我国西北部，是一种食用油料树种，寿命可超过200 年，具有很高的经济价值［8-10］，其叶中也含有大量黄酮类化合物［11］。目前，对文冠果的研究主要集中在育苗、种植［12-13］、不同部位挥发油提取、理化性质、成分分析等方面［14-18］，而关于黄酮提取及其生物活性方面的报道相对较少。因此，本实验进行微波辅助酶提取文冠果叶总黄酮，通过响应面法优化该成分提取工艺，并对其抗氧化、抑菌活性进行初步探索，旨在为油料作物多重开发提供理论依据。

1 材料

文冠果叶采自山东，经山西中医药大学中医学院裴香萍副教授鉴定为正品。芦丁对照品（纯度＞98%）购自上海金穗生物科技有限公司；纤维素酶（活性1.5 万U/g）购自上海如吉生物科技有限公司；茶多酚（纯度＞98%）购自上海今品化学技术有限公司。DPPH·、ABTS·购自美国Sigma 公司；大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。VIS-7220型光度计购自上海棱光科技有限公司；XH-10A 型微波仪购自北京祥鹄科技有限公司；DHP-9082 型恒温培养箱购自上海雷韵实验仪器有限公司；HB-10 型旋蒸仪购自德国IKA 公司；FA-2104 型数显电子分析天平购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司。氢氧化钠、氯化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇、磷酸、浓盐酸等均为分析纯，购自天津化学试剂有限公司。

2 方法

2.1 总黄酮提取 采用微波辅助酶法。将文冠果叶烘干、粉碎、过60 目筛后，称取0.5 g 粉末于50 mL 圆底烧瓶中，加入3 mL 磷酸盐缓冲液（pH=4.5）和适量纤维素酶，55 ℃下水浴酶解60 min后沸水浴灭酶，冷却10 min，加入适量乙醇室温浸泡0.5 h，微波提取，2 000 r/min 离心10 min，取上层清液，洗涤后合并滤液，抽滤，浓缩，即得提取物。

2.2 总黄酮含有量测定

2.2.1 线性关系考察［19］以吸光度为纵坐标（A），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程为A=8.517 0X+0.006 2（R2=0.999 2），在0～70 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.2.2 提取率测定 公式为提取率=（黄酮含有量/样品粉末量）×100%。

2.2.3 重复性试验［20］配制0.1 mg/mL 芦丁对照品溶液，于0、2、4、6、8、10 h 测定吸光度，测得其RSD 为0.198%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 精密度试验 取0.1 mg/L 芦丁对照品溶液，连续测定吸光度6 次，测得其RSD 为0.346%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 加样回收率试验 取0.050 6 mg/L 提取液10 mL，共9 份，置于50 mL 量瓶中，加入0.063 2、0.050 6、0.042 2 mg/L 芦丁对照品溶液10 mL，共3 份，75%乙醇定容，测定吸光度，计算加样回收率。结果，3 份溶液回收率分别为98.7%、99.5%、101.0%，RSD 为1.58%。

2.3 单因素试验

2.3.1 微波功率 固定样品粉末用量0.5 g，纤维素酶用量0.15%，乙醇体积分数60%，料液比1∶10，微波提取时间3 min，选择微波功率400、500、600、700、800 W，按“2.1”项下方 法提取。

2.3.2 微波提取时间 固定样品粉末用量0.5 g，纤维素酶用量0.15%，乙醇体积分数60%，料液比1∶10，微波功率600 W，选择微波时间1、3、5、7、9 min，按“2.1”项下方法提取。

2.3.3 料液比 固定样品粉末用量0.5 g，纤维素酶用量0.15%，乙醇体积分数60%，微波功率600 W，微波提取时间5 min，选择料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，按“2.1”项下方法提取。

2.3.4 乙醇体积分数 固定样品粉末用量0.5 g，纤维素酶用量0.15%，料液比1∶20，微波功率600 W，微波提取时间5 min，选择乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%，按“2.1”项下方法提取。

2.3.5 纤维素酶用量 固定样品粉末用量0.5 g，乙醇体积分数70%，料液比1∶20，微波功率600 W，微波提取时间5 min，选择纤维素酶用量0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，按“2.1”项下方法提取。

2.4 响应面法优化 在单因素试验基础上，选择微波功率（A）、微波提取时间（B）、乙醇体积分数（C）作为影响因素进行试验，因素水平见表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.5 抗氧化活性测定

2.5.1 药液配制 将最优条件下得到的提取液在50～55 ℃下浓缩至2.01 mg/mL，75%乙醇依次稀释至5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 μg/mL，并配制相同质量浓度维生素C、芦丁溶液作为对照，冷藏备用。

2.5.2 对DPPH·的清除能力［20］公式为清除率=，其中Ai为样品组（提取液+DPPH 溶液）吸光度，Aj为等体积无水乙醇代替DPPH 溶液的对照组吸光度，A0为等体积蒸留水代替提取液的空白组吸光度。

2.5.3 对ABTS·的清除能力（对文献［20］稍作改动）精密称取0.040 g ABTS 加入1.0 mg/mL K2S2O8溶液8.0 mL，密封避光反应16 h，置于250 mL 量瓶中，加入32 mL 去离子水，95% 乙醇定容，静置10 h，作为ABTS 工作液。然后，精密吸取不同质量浓度提取液（或芦丁、维生素溶液）各0.50 mL，加入0.80 mL ABTS 工作液，再加入2.70 mL 80%乙醇，反应6 min 后在734 nm 波长处测定吸光度，参比液为75%乙醇与无水乙醇（1∶1）混合液，按“2.5.2”项下公式计算。

2.6 抑菌活性测定

2.6.1 被测菌种扩培 参考文献［21］方法进行操作。

2.6.2 抑菌实验 将提取液按“2.5.1”项下方法浓缩后，室温下晾干冷藏。50%乙醇配制总黄酮粗提物、茶多酚供试液，药液质量浓度分别为8.56、4.28、2.14 mg/mL。滤纸片法［22］测定粗提物、茶多酚抑菌活性，方法为将培养基在37 ℃恒温箱中保温48 h 后，测定抑菌圈直径（十字交叉测2 次，取平均值），公式为抑菌圈直径=抑菌圈外径-滤纸片直径。

3 结果

3.1 单因素试验

3.1.1 微波功率［23］图1 显示，总黄酮提取率随着微波功率升高而先增后减，其原因是微波离子传导作用可随其功率增大而加强，促使文冠果叶细胞膜膨化、破裂，总黄酮，于功率为600 W 时全部溶出；继续增大微波功率时，不但损耗能量，而且过剩的热效应会促使总黄酮分解［24］，故确定微波功率为600 W。

图1 微波功率对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of microwave power on the extraction rate of total flavonoids

3.1.2 微波提取时间 图2 显示，当微波提取时间小于5 min时，总黄酮提取率随着时间延长热效应逐渐加强，释放量随之增大，在5 min 时最高，表明该成分已完全释放；在7 min 时，提取率略有下降；在9 min 时，提取率迅速下降，主要是由于过量热效应可使总黄酮分解，故确定微波时间为5 min。

图2 微波提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of microwave time on the extraction rate of total flavonoids

3.1.3 料液比 图3 显示，随着料液比中乙醇用量增加，总黄酮逐渐被溶出，提取率逐渐增加；但其过量时，反而会因杂质溶出而导致总黄酮提取率下降，故确定料液比为1∶20。

图3 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

3.1.4 乙醇体积分数 图4 显示，当乙醇体积分数小于70%时，总黄酮提取率随着其升高而增加，并在70% 时达到溶解平衡，提取率最高；大于70%时，过量渗透压会将文冠果叶中杂质溶出，导致提取率反而下降，故确定乙醇体积分数为70%。

图4 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

3.1.5 纤维素酶用量［25］图5 显示，当纤维素酶用量在0.05%～0.20%之间时，随着文冠果叶细胞壁被逐渐破坏，总黄酮被逐渐释放出，其提取率也随之增加；在0.20%～0.25%之间时，提取率却在下降，这是因为过度破坏细胞壁会增加杂质溶出，故确定纤维素酶用量为0.20%。

3.2 响应面法优化 通过Design-Expert 8.0.5 软件，以总黄酮提取率为评价指标（Y）进行优化，结果见表2，回归方程为Y=9.86-0.14A+0.46B-0.065C-0.167AB+0.34AC-0.063BC-0.21A2-0.28B2-0.21C2。

图5 纤维素酶用量对总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of cellulase consumption on the extraction rate of total flavonoids

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

方差分析见表3。由此可知，模型P＜0.000 1，表明模型显著；失拟项P＞0.05，表明模型失拟性不显著；R2为0.999 6，表明模型回归显著，准确度高；为0.999 0，表明总黄酮提取率与各因素之间相关度较高；CV 仅为0.72%，表明模型可靠性高；模型F值与变量对响应值影响呈正比［26］，故各因素影响程度依次为微波提取时间（B）＞微波功率（A）＞乙醇体积分数（C），与单因素试验结果一致；两因素相互作用影响程度依次为AC＞BC＞AB。响应面分析见图6。

3.3 验证试验 最优工艺为纤维素酶用量0.20%，乙醇体积分数70.10%，料液比1∶20，微波功率597.19 W，提取时间6.49 min，总黄酮提取率为9.92%，结合实际生产操作，将其修正为微波功率600 W，提取时间6 min，乙醇体积分数70%，其他条件不变。然后，进行3 批验证试验，测得总黄酮平均提取率为9.90%，接近预测值9.92%，表明模型拟合情况良好。

图6 各因素响应面图Fig.6 Response surface plots for various factors

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

3.4 抗氧化活性

3.4.1 对DPPH·的清除能力 图7显示，各样品对DPPH·的清除能力依次为维生素C＞总黄酮＞芦丁，并均在被测质量浓度范围内呈良好的线性关系，R2在0.959 6～0.982 2 之间，IC50分别为3.82、12.23、49.36 μg/mL，其中维生素C、总黄酮清除能力均随着其质量浓度升高而增强，而芦丁受其影响相对较小。另外，总黄酮质量浓度为15.00 μg/mL时清除能力较小，可能是由于实验误差所致，需作进一步研究。

图7 各样品对DPPH·的清除能力Fig.7 Scavenging abilities of various samples on DPPH·

3.4.2 对ABTS·的清除能力 图8显示，各样品随着其质量浓度升高对ABTS·的清除能力也随之加强，其中总黄酮在低质量浓度下与维生素C 差距较大，而与芦丁接近，但进一步升高时逐渐接近维生素C，同时三者均在被测质量浓度范围内呈良好的线性关系，R2在0.972 0～0.984 8 之间，IC50分别为1.59、14.59、42.90 μg/mL。与DPPH·比较，总黄酮对ABTS·的清除能力相对较弱，质量浓度均为25.00 μg/mL 时低了2.60%。

图8 各样品对ABTS·的清除能力Fig.8 Scavenging abilities of various samples on ABTS·

3.5 抑菌活性 表4 显示，总黄酮、茶多酚对3种革兰氏菌的抑制作用随着其质量浓度升高而加强，程度依次为大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌，其中总黄酮质量浓度为8.56、4.28、2.14 mg/mL 时抑菌圈直径分别比茶多酚大了1.12、0.38、0.06 mm，比95% 乙醇大了0.42、1.04、0.80 mm；对金黄色葡萄球菌的抑制作用相对较弱，仅其质量浓度为8.56 mg/mL 时抑菌圈直径比茶多酚大0.30 mm，但整体上仍比95% 乙醇强；在质量浓度8.56 mg/mL 下对枯草芽孢杆菌的抑制作用比茶多酚强，而在8.56、4.28 mg/mL 下强于95%乙醇。

表4 各样品抑菌活性测定结果（）Tab.4 Results of bacteriostasis activity determination of various samples（）

表4 各样品抑菌活性测定结果（）Tab.4 Results of bacteriostasis activity determination of various samples（）

4 结论

本实验所得最优文冠果叶总黄酮微波辅助酶提取工艺为磷酸缓冲液（pH=4.5）3 mL，纤维素酶用量0.20%，乙醇体积分数70%，料液比1∶20，微波功率600 W，提取时间6 min，总黄酮提取率为9.90%，接近于预测值，表明工艺准确可靠，比郝倩［11］等报道的超声法提高了2.44 倍。总黄酮提取液对DPPH·、ABTS·均有较强的清除能力，对前者作用更强，虽然略低于维生素C，但明显高于芦丁；对3 种革兰氏菌均有较强的抑制作用，程度依次为大肠杆菌＞金黄色葡萄球杆菌＞枯草芽孢杆菌，并且对大肠杆菌的抑菌活性明显强于茶多酚，而对后两者则相对较弱。

综上所述，文冠果叶总黄酮不但具有较强的抗氧化能力，还有着良好的抑菌活性（尤其是对大肠杆菌），表明该植物可作为天然抗氧化剂和抑菌剂应用于食品、保健品等行业，开发前景广阔。