长链非编码RNA LINC00483抑制miR-204-3p对结直肠癌细胞侵袭转移的实验研究

闫颜 汪茜 秦宝丽

结直肠癌是第三常见的消化系统恶性肿瘤。作为第三常见的导致癌症相关死亡的疾病，每年约有1 360 000 例新发的结直肠癌病例确诊，并且每年约有700 000例结直肠癌患者死亡[1]。尽管随着结直肠癌治疗的系统化及联合抗肿瘤疗法的进一步开展，结直肠的致死率已经降低到约35%左右，仍有超过一半或更多的结直肠癌患者最终死于远处转移[2]。因此，找到新的与结直肠癌侵袭转移密切相关的靶分子并明确其作用机制，对分子靶向治疗结直肠癌的开展及新的靶向药物的开发都具有极强的理论和实际意义。近年来，越来越多的学者将关注的重点放在非编码RNA(noncoding RNAs，ncRNAs)与肿瘤领域。非编码RNA是一大类不具有蛋白质编码能力的RNA转录物。根据其长度，非编码RNA被分成长链非编码RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)与微小RNA(microRNAs，miRNAs)[3,4]。长链非编码RNA是指长度超过200个核苷酸的非编码RNA。长链非编码RNA在结直肠癌中广为表达并且与结直肠癌的多种恶性表型密切相关。Wang等[5]研究发现长链非编码RNA DANCR可通过竞争性抑制miR-577的方式促进热休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)的表达并促进结直肠癌细胞增殖及侵袭转移。Wang等[6]报道称长基因间非编码RNA 460(long intergenic non-protein coding RNA 460，LINC00460)在结直肠癌中表达升高，LINC00460能够促进结直肠癌细胞系SW620和HCT116细胞的增殖。目前，关于长基因间非编码RNA 483(long intergenic non-protein coding RNA 483，LINC00483)在结直肠癌中表达及其对结直肠癌侵袭转移作用的研究鲜有报道。MiRNAs在肿瘤中的作用同样是非编码RNA研究领域的又一热点话题。miRNAs在包括结直肠癌在内的多种肿瘤中广为表达且发挥着多种生物学作用。Yan等[7]研究发现微小RNA 495 (microRNA-495，miRNA-495)能够通过打靶(family with sequence similarity 83 member D，FAM83D)的方式抑制结直肠癌细胞增殖及侵袭转移。目前关于微小RNA 204-3p(microRNA-204-3p，miR-204-3p)在结直肠癌中作用的研究不多。在本研究中，我们初步探讨了LINC00483及miR-204-3p在结直肠癌中表达及其对结直肠癌细胞系HT29及LOVO细胞侵袭转移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

1.1.1 组织标本：我们收集了70例2015年1月至2018年6月在辽宁省肿瘤医院接受结直肠癌肿瘤切除术患者的结直肠癌组织及配对的癌旁组织标本，其中结肠癌37例，直肠癌33例。所有患者经病理学检查证实诊断为结肠癌和或直肠癌。其中男34例，女36例;年龄51～77岁，平均(63.2±10.4)岁，所有患者术前均未接受放疗或化疗。

1.1.2 细胞系：人正常肠上皮细胞系NCM460和人结肠癌细胞系HT29及LOVO购自中科院上海细胞库。

1.1.3 主要试剂：RPMI1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco公司；青霉素、链霉素购于上海宝曼生物科技有限公司；TRIzol及Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购于德国Roche公司；Transwell小室购自美国Corning公司；特异性LINC00483干扰寡核苷酸(siLINC00483)及错义对照寡核苷酸(siscramble，siSCR)，miR-204-3p抑制物(miR-204-3p inhibitor)及抑制物对照(negative control inhibitor， NC inhibitor)均由广州锐博生物科技有限公司设计合成；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:人正常肠上皮细胞株NCM460及人结肠癌细胞株HT29和LOVO均接种于RPMI1640培养基并添加10% FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素，并置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。待细胞融合率达80%时，以0.25%胰蛋白酶消化并传代。

1.2.2 细胞转染:取生长状态佳的HT29和LOVO细胞调整密度为2×105个细胞/孔接种于6孔板中，24 h后，利用Lipofectamine2000将siSCR及siLINC004

83、NC inhibitor及miR-204-3p inhibitor分别转染和或共转染至HT29和LOVO细胞中，具体操作严格按照转染试剂盒说明书进行。48 h后进行后续实验。

1.2.3 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应:(reverse transcription and quantitative PCR，qRT-PCR) LINC00483及miR-204-3p的表达均采用qRT-PCR的方法进行。参照Trizol说明书提取组织及细胞的总RNA并分组标记。取5 μg总RNA进行逆转录反应以合成cDNA，反应产物按实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR扩增，设定GAPDH作为内参，具体反应条件如下：95℃预变性15 s；95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，共45个循环。见表1。

表1 引物序列表

1.2.4 Transwell实验:采用文献报道的方法[8]进行Transwell实验检测HT29及LOVO细胞侵袭转移能力，具体操作主要参照Transwell小室说明书进行。简要描述如下：常规包被底部膜，水化。将不同转染处理48 h的HT29和LOVO细胞接种于Transwell上室内，接种密度为5×104个/孔。在上室内加入100 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，下室内加入500 μl含20%胎牛血清的RPMI1640培养基，并置于37℃、5% CO2的孵箱中孵育。48 h后取出Transwell小室，棉签拭去Transwell小室内部细胞，冲洗、固定、染色后倒置显微镜下观察并计数穿膜细胞数。每组铺6个Transwell小室，取其平均值。

2 结果

2.1 结直肠癌中长链非编码RNA LINC00483的表达升高而miR-204-3p表达降低 qRT-PCR检测结果提示，相比于癌旁组织，LINC00483在绝大部分(65/70，92.86%)结直肠癌组织标本中表达增高。qRT-PCR检测结果显示，miR-204-3p在大部分结直肠癌组织标本中表达降低，相比于正常肠上皮细胞系NCM460，结直肠癌细胞系HT29及LOVO中的LINC00483表达增高而miR-204-3p表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1，表2。

图1 LINC00483及miR-204-3p在结直肠癌组织及细胞系中的表达

类别LINC00483miR-204-3pNCM4601.00±0.101.10±0.13HT29 7.36±0.42∗0.23±0.06∗LOVO 6.87±0.48∗0.25±0.06∗F值414.60257.80P值<0.0001<0.0001

注：与NCM460组比较，*P<0.01

2.2 长链非编码RNA LINC00483及微小RNA miR-204-3p的表达与结直肠癌患者不良病理参数密切相关 分别根据LINC00483及miR-204-3p在本研究所收集的70例样本中相对表达的中位值，我们将这70例患者分别分成LINC00483高表达组与LINC00483低表达组以及miR-204-3p高表达组与miR-204-3p低表达组。高表达的LINC00483和低表达的miR-204-3p均与结直肠癌的更高的临床分期(P=0.027和P=0.000)、更高的TNM分期(P=0.001和P=0.008)、淋巴结转移(P=0.015和P=0.004)和远处转移(P=0.004和P=0.001)密切相关。见表3。

表3 结直肠癌中LINC00483和 miR-204-3p 的表达与临床病理参数的相关性分析 例

2.3 下调LINC00483可促进结直肠癌细胞HT29及LOVO中miR-204-3p的表达并抑制其迁移 在HT29及LOVO细胞中分别转染LINC00483 siRNA(siLINC00483)及相应的错义对照寡核苷酸(siSCR)并通过qRT-PCR确认。相比于转染siSCR组，转染siLINC00483后HT29及LOVO细胞内LINC00483的表达明显降低(P<0.01)，即证实转染获得了成功。转染siLINC00483也就是下调LINC00483后，miR-204-3p的表达明显增高(P<0.01)。相比于siSCR组，转染siLINC00483也就是下调LINC00483后，HT29及LOVO细胞的迁移能力明显降低(P<0.01)。见图2，表4、5。

图2下调LINC00483可抑制HT29及LOVO细胞的迁移能力(结晶紫染色×40)

2.4 下调miR-204-3p的表达可部分逆转LINC00483 siRNA对HT29和LOVO细胞迁移的抑制作用 我们将LINC00483 siRNA与miR-204-3p inhibitor进行了共转染，LINC00483 siRNA对miR-204-3p表达的促进作用明显被miR-204-3p所削弱(P<0.01)。相比于共转染LINC00483 siRNA + NC inhibitor组，共转染LINC00483 siRNA + miR-204-3p inhibitor组的HT29和LOVO细胞的侵袭能力明显得到了部分增强(P<0.01)，即下调miR-204-3p的表达可部分逆转LINC00483 siRNA对HT29和LOVO细胞迁移的抑制作用。见图3，表6、7。

类别LINC00483HT29LOVOmiR-204-3pHT29LOVOsiSCR 1.00±0.921.00±0.851.00±0.881.00±0.79siLINC004830.33±0.04∗0.42±0.07∗9.85±0.05∗1.16±0.12∗P值<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001

注：与siSCR组比较，*P<0.01

类别HT29LOVOsiSCR 1.00±0.141.10±0.11siLINC004830.48±0.050.37±0.06P值<0.0001<0.0001

图3 下调miR-204-3p的表达可部分逆转LINC00483 siRNA对HT29和LOVO细胞迁移的抑制作用(结晶紫染色×40)

类别HT29LOVOsiSCR1.00±0.111.10±0.09siLINC004839.44±0.419.25±0.46siLINC00483+NC inhibitor9.31±0.569.37±0.47siLINC00483+miR-204-3p inhibitor0.33±0.060.32±0.04 F值631.60698.30 P值<0.0001<0.0001

类别HT29LOVOsiSCR1.00±0.111.10±0.09siLINC004830.36±0.060.44±0.06siLINC00483+NC inhibitor0.33±0.050.43±0.05siLINC00483+miR-204-3p inhibitor1.74±0.221.68±0.14 F值102.50158.90 P值<0.0001<0.0001

3 讨论

作为非编码RNA(noncoding RNAs)家族中的重要组成成员，lncRNAs指的是一大类长度超过200个碱基的长链大分子RNA转录物[9]。长链非编码RNA作用机制极为复杂，包括作为支架或向导调控蛋白与基因的相互作用，通过“海绵”的方式与微小RNA(microRNA，miRNA)相结合，作为增强子调控其下游靶基因的转录等等[10,11]。长链非编码RNA广泛参与到包括肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移等多个生物学行为过程[3,12]。

作为一种新的长链非编码RNA，长基因间非编码RNA 483(long intergenic non-protein coding RNA 483，LINC00483)全长含有825个碱基，其在人染色体的位置是17q21.33。Li等[13]发现LINC00483在胃癌中表达增高并与胃癌患者的不良预后密切相关，LINC00483可通过与miR-30a-3p相结合并且以竞争性内源性RNA的方式促进精子相关抗原9(sperm associated antigen 9，SPAG9)的表达从而提高胃癌细胞系BGC823的增殖及侵袭转移能力。在本研究中，关注了LINC00483在结直肠癌中的表达情况，发现LINC00483在绝大部分结直肠癌组织中表达增高，进一步的细胞学检测同样证实其在在结直肠癌细胞系HT29及LOVO中表达明显高于正常肠上皮细胞系NCM460，提示其在结直肠癌中可能发挥着癌基因的角色。通过进一步的Pearson卡方分析，发现，高表达的LINC00483与结直肠癌患者的更高的临床分期、更高的TNM分期、淋巴结转移和远处转移密切相关，提示LINC00483可能参与结直肠癌的进展及侵袭转移。为了证实我们的设想，我们通过构建的功能缺失实验考察了不同表达水平的LINC00483 对结直肠癌迁移能力的影响。发现下调LINC00483后结直肠癌细胞系HT29和LOVO的迁移能力明显降低。同时，我们发现，下调LINC00483可明显提高HT29和LOVO细胞内miR-204-3p的表达。

人miR-204-3p位于人染色体9q21.12，全长仅有21个碱基。MiR-204-3p在多种恶性肿瘤中都扮演着抑癌基因的作用。Chen PH研究发现，miR-204-3p可促进黄腐酚诱导的胶质瘤细胞凋亡[14]。Li等[15]报道称，长链非编码RNA BRM可通过吸附miR-204-3p的方式上调翻译调节肿瘤蛋白1(tumor protein,translationally- controlled 1，TPT1)的表达并促进结直肠癌细胞增殖及侵袭转移。本研究中，首先考察了miR-204-3p在结直肠癌组织及细胞系中的表达情况。与Li等[15]的研究结果相类似，我们同样发现miR-204-3p在结直肠癌组织及细胞系中表达降低。此外，通过Pearson卡方检验发现，低表达的miR-204-3p也与结直肠癌患者的更高的临床分期、更高的TNM分期、淋巴结转移和远处转移密切相关。结合前部分的LINC00483的检测结果，我们推断两者可能协同参与到结直肠癌的进展及侵袭转移过程中。我们检测了不同LINC00483表达水平对miR-204-3p表达的影响。结果发现，当我们下调LINC00483后，miR-204-3p的表达明显上调。进一步，我们通过功能学实验验证miR-204-3p在LINC00483介导的结直肠癌细胞系HT29及LOVO迁移中的作用。我们发现，下调LINC00483可明显抑制HT29及LOVO细胞迁移，而当我们在这个构建的LINC00483敲低表达的细胞模型中进一步沉默miR-204-3p的表达后，HT29及LOVO细胞的迁移能力复又增高。以上研究提示，miR-204-3p是LINC00483下游的重要靶基因，两者均参与到结直肠癌细胞的迁移过程。

肿瘤的侵袭转移是一个极为复杂的涉及到多因子多通路的细胞学过程。同大多数恶性肿瘤一样，结直肠癌的侵袭转移同样是多个分子调控网络协同作用的结果。我们的研究仅仅揭示了LINC00483/miR-204-3p轴在结直肠癌迁移过程中的作用。长链非编码RNA及微小RNA下游的靶基因众多，我们会在进一步研究中深入探讨这两个分子的具体作用机制并找寻其协同作用的靶分子，为分子水平治疗结直肠癌的开展提供新视野。