猪非典型性瘟病毒（APPV）研究进展

武 省，曾 莉，潘永飞，宋延华

（温氏食品集团股份有限公司，新兴 527400）

瘟病毒是一类有囊膜高度变异的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科瘟病毒属，可感染猪、反刍动物和野生动物等。目前正式确定的瘟病毒有4个成员：猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、牛病毒性腹泻病毒1型（Bovine viral diarrhea virus 1，BVDV-1）、牛病毒性腹泻病毒2型（Bovine viral diarrhea virus 2，BVDV-2）和边界病毒（Border disease virus，BDV）[1]。近几十年来，包括长颈鹿瘟病毒（Giraffe pestivirus）、羚羊瘟病毒（Pronghorn antelope virus）、瘟病毒（Bungowannah virus）、鼠瘟病毒（Rat pestivirus）、非典型反刍鼠疫病毒（Atypical ruminant pestivirus，Hobi-like）、猪非典型性瘟病毒（Atypical porcine pestivirus，APPV）和Linda病毒（Lateral-shaking inducing neurodegenerative agent，LV）等新的瘟病毒在家畜和野生动物中陆续被发现[1]。其中，近两年来APPV被相继报道与仔猪先天性震颤（congenital tremor，CT）密切相关[2-3]。

仔猪先天性震颤，俗称“仔猪抖抖病”或“跳跳病”，是指刚出生仔猪头部、四肢等局部或全身肌肉表现阵发性挛缩的一种疾病，可导致仔猪站立困难、吮乳受阻甚至死亡[3-4]。根据大脑和脊柱是否有组织学损伤，将CT分为A型和B型，B型没有组织学损伤，A型有组织学损伤，A型又可分为AⅠ～AⅤ等5种亚型[4-5]。其中，AⅢ和AⅣ型是染色体隐性遗传所致，AⅤ型由敌百虫等化学物质引起的；相比较而言，AⅠ和AⅡ型是病毒引起的CT，AⅠ型是CSFV引起的，AⅡ型是未知病毒引起的。目前，AⅡ型CT被认为是规模化养猪场一胎母猪分娩仔猪出现CT的主要类型。美国和荷兰研究者将APPV接种于一胎妊娠母猪，所分娩的新生仔猪表现CT症状，证明APPV可造成仔猪的AⅡ型先天性震颤[3,6]。2015年，美国首次发现APPV，随后德国、荷兰、西班牙、澳大利亚、英国、中国、加拿大和巴西等国家相继报道在CT症状的新生仔猪检测出APPV，表明了APPV已在世界范围内流行，对养猪业存在重大地潜在威胁[2-3,6-13]。因此，本文主要针对APPV最新的流行现状、病原特征和诊断等进行综述，旨在提供APPV最新研究进展，提高同行对该病的初步认识和了解，为该病的防控提供理论依据和参考。

1 APPV的发现与流行现状

自2015年美国科研人员利用宏基因组学技术从猪血清中偶然发现APPV后，北美、欧洲、亚洲和南美等国家陆续报道APPV存在（表1）。最初，Arruda等[6]报道从临床表现为CT的仔猪样品（血清、大脑、小脑、脊髓、脑脊液和肺脏）中检测到APPV。随后将APPV人工接种头胎妊娠母猪（妊娠期45或62 d），结果显示接种组分娩的仔猪出现CT症状，且CT仔猪均可检测出APPV核酸，而未接种对照组分娩的仔猪正常，APPV检测为阴性，从而证明APPV可造成新生仔猪的AⅡ型先天性震颤。2016年，德国学者对一暴发CT猪场新生仔猪的脑组织样品进行检测，结果仅检测到APPV阳性，其基因组与美国株同源性为88.2%[8]。同样对来自德国29猪场的369份成年猪血清进行调查，PCR结果显示不同猪场APPV阳性率为2.4%～10%[2]。de Groof等[3]对荷兰发生APPV疫情猪场调查，分析发现CT主要发生在一胎母猪所分娩的仔猪，该场20周内一胎猪共分娩231窝，其中48窝新生仔猪出现CT症状，窝均发生率为10%～100%，公/母仔猪均可发病，患病仔猪死亡率可高达60%。2017年，Arruda等[9]报道澳大利亚一APPV发病猪场情况，疫情期间80%的一胎母猪发生疫情，其中约70%的新生仔猪表现不同程度的CT症状，PSY（每头母猪年断奶仔猪数）由疫情前的26.5头降低至23.57头，表明APPV可严重影响一胎母猪繁殖成绩（约下降10%）。Gatto等[14]和Mósena等[11]对巴西不同猪场APPV疫情调查，分析发现APPV仅造成一胎猪分娩仔猪发生CT症状，仔猪患病率为16%～77.3%、死亡率为0.5%～30%。患病猪剖检无肉眼可见病变，免疫组化显示患病猪的小脑和脑干出现脑白质空泡化。Dessureault等[12]对加拿大一突然暴发APPV疫情猪场调查显示，该场头胎母猪发生率为26.3%（5/19），仔猪患病率为100%（61/61），窝仔猪死亡率为13.3%～41.2%，存活的患病仔猪在断奶时震颤症状已消失。Dénes等[15]对匈牙利6个不同猪场25起CT疫情的仔猪样品检测，结果显示所有样品均为APPV阳性，回溯性研究表明，APPV至少自2005年开始已在匈牙利猪群流行存在。同样，西班牙的一项20年（1997-2016年）猪血清学回溯性研究发现，早在1997年APPV就已经出现在西班牙猪群中[10]。自2016年以来，我国广东、广西、四川、云南和江西等规模化猪场也相继报道在CT猪群中检测出APPV[13,16-17]。此外，美国与德国有研究报道在健康猪群也能检测出APPV，检测阳性率为2.4%～22%。Postel等[18]对来自欧洲（英国、意大利、德国、塞尔维亚和瑞士）和中国（大陆和台湾）的1460份健康猪血清进行APPV检测，PCR结果显示APPV血清阳性率为8.9%（130/1460），欧洲和中国的阳性率分别为2.3%～17.5%和5%～11%。同样，Yuan等[19]对中国10个猪场的135份健康猪血清调查，发现5个猪场检测出APPV，样品阳性率为5.5%。上述研究结果表明，APPV在CT症状猪群和健康猪群是普遍流行的，且在世界范围内传播。近期研究发现，德国和西班牙野猪血清APPV检测阳性率分别19%和0.2%，表明野猪可能是APPV的重要贮存宿主[20-21]。

表1 不同国家APPV检测情况Table 1 Detection of atypical porcine pestivirus infection in pigs from different countries

2 病原学特征

APPV属于黄病毒科瘟病毒属，是一种单股正链RNA病毒。基因组约12 kb，包括5'和3'非编码区及1个多聚蛋白阅读框（open reading frames，ORF）[7]。该阅读框编码一个含3635个氨基酸的多聚蛋白前体，可被蛋白酶水解成多个蛋白，其编码顺序为Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-3-NS4ANS4B-NS5A-NS5B，其中C、Erns、E1和E2为病毒的结构蛋白，Npro、p7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B为病毒的非结构蛋白。分子系统进化树分析研究表明，APPV基因组与其他瘟病毒同源性低于68%，不同地理区域APPV株基因组同源性为83%～94%[7]。de Groof等[3]将2012-2016年间荷兰APPV毒株分为A/B/C三个基因型，其中型内核苷酸异源性在3%～5%，型间异源性约为10%，同源性曲线分析表明编码区并没有特别保守的序列。此外，在同一猪场2012-2014年间测序获得的不同APPV株均在同一型内，但是也出现不同程度的毒株进化，表明APPV基因高度变异。Mósena等[11]对源自巴西不同州APPV毒株的NS5B基因序列比对显示，同一地区毒株同源性为92.9%～99.7%，不同地区同源性为83.2%～88.9%。Pan等[17]利用ORF、Npro和E2基因分别将APPV株划分为O1-4基因型、N1-6基因型和E1-6基因型。

目前，主要通过定量PCR研究APPV在不同组织器官的分布情况。Munoz-Gonzalez等[10]研究APPV在患病仔猪不同组织的含量分布情况，结果显示扁桃体、脾脏和胸腺器官具有最高病毒含量，脑脊液、脑组织、血清和鼻/直肠拭子具有中等病毒含量。同样，Yuan等[19]研究发现在患病猪的各种组织均可检测出APPV，但病毒含量最高的为下颌淋巴结，中等病毒含量的为外周淋巴器官（脾脏、扁桃体和腹股淋巴结）、中枢神经系统（脑干、大脑和小脑等）和消化系统（十二指肠）。上述研究结果显示淋巴器官含有大量的APPV，表明淋巴器官可能是APPV复制的重要靶器官，推测APPV可以抑制宿主免疫系统。另外，Postel等[2]利用定量PCR和免疫荧光原位杂交技术检测APPV，发现CT仔猪小脑颗粒细胞层有中等含量的病毒，直接证明了APPV可感染仔猪的中枢神经系统。

最初研究者利用猪肾细胞系（PK15、IBRS、SK6和ST）尝试进行APPV分离，但都没有成功。最近有研究报道APPV能够在不同的猪细胞上分离和传代，但病毒滴度较低，病毒的持续传代培养仍未取得突破性进展[8-9,18]。考虑到APPV毒株具有高度变异的特性，一些特殊的毒株可能会成功被体外分离培养。另外，目前报道的人工APPV复制病例都是用含APPV的血清进行攻毒的[3,6]。因此，需要体外分离培养的纯病毒来进一步验证APPV感染致病模型。

3 临床表现与病理变化

APPV的临床症状表现为新生仔猪先天性震颤，以四肢、头部或全身出现节奏的震颤为临床特征，导致患病仔猪不能正常站立、吮乳，患病仔猪死亡率可高达30%，成年猪呈隐性感染。临床生产中主要是一胎母猪所分娩的仔猪感染APPV发生CT，推测其他胎次仔猪可能与通过母源抗体获得保护有关。最近研究表明，APPV与猪捷申病毒（Porcine teschovirus，PTV）混合感染会增加仔猪的死亡率[22]。

APPV发病仔猪剖检无明显大体病变。APPV引起的AⅡ型CT仔猪组织病理特征为脑白质空泡化，进一步观察其超微结构为小脑和脊髓髓鞘形成减少和破坏及脑白质髓磷脂崩解[9,11-12]。此外，免疫组化显示患病猪脊髓少突胶质细胞减少，表明APPV可能对胎儿少突胶质细胞有毒害作用，影响髓磷脂的形成，导致其功能丧失[9]。

人工感染实验表明APPV可通过胎盘感染胎儿。为研究APPV能否垂直传播，美国和荷兰研究人员对妊娠（32 d、45 d和62 d）母猪以肌注或子宫方式接种APPV，结果显示接种APPV母猪分娩的新生仔猪表现CT症状，且患病仔猪的各种组织样品均检测出APPV，证明了APPV可通过胎盘传播，推测胎儿发育期感染APPV会造成胎猪中枢神经损伤，从而导致新生仔猪表现CT症状[3,6]。另外，研究发现APPV与CSFV、BVDV等瘟病毒同样也可能通过精液传播。荷兰、澳大利亚曾报道在出生时表现过CT症状的成年公猪的精液和包皮液中检测出APPV，表明感染过APPV的公猪可短暂性地或持续性地通过精液排毒[3,9]。Gatto等[23]对美国3个州的4个商品化公猪站样品（114份包皮液、21份包皮拭子和457份精液）进行APPV检测，结果显示样品总阳性率为15.1%（90/597），包皮液、包皮拭子和精液阳性率分别为22.8%、23.8%和12.9%。近期，Postel等[2]研究发现在曾患病猪的唾液腺、十二指肠、结肠和胰腺器官也可检测出APPV，表明APPV可能通过粪-口途径传播。

4 病原检测

目前，APPV的诊断主要依靠实验室检测与临床症状相结合。实验室检测方法主要有PCR病原学和血清学检测。PCR检测主要包括常规PCR和实时荧光定量PCR。PCR扩增主要以E2、NS3、NS4和NS5等靶基因进行APPV检测，临床上可采集震颤猪的脑、淋巴结和血清等样品来进行检测[24]。APPV抗体检测主要以Erns、E2、NS3等靶蛋白建立的ELISA法。Schwarz等[9]利用NS3蛋白制备的单克隆抗体建立的阻断ELISA法调查澳大利亚猪群APPV感染情况，结果显示168份母猪血清和2份公猪血清中有59份母猪和1份公猪血清为阳性，样品阳性率为35.3%。黎振标等[25-26]制备了APPV原核表达的Erns和E2蛋白，以其作为包被抗原，建立了间接ELISA检测方法，结果表明该方法灵敏度达到1∶64，特异性好，与猪瘟、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪流感及猪圆环病阳性血清均不发生交叉反应，该方法的建立为APPV的流行病学调查和临床诊断提供了有效的工具。

5 展望

综上所述，APPV是近三年来新发现的一种新型瘟病毒，由其引起的仔猪先天性震颤发病率、致死率呈上升趋势，给养猪业生产造成了较大的经济损失。目前国内针对APPV的研究尚处于起步阶段，一方面，应尽快开展APPV检测技术研究，建立快速、灵敏、特异病的原学和血清学检测方法，做好诊断技术储备；另一方面，应加强APPV分离鉴定，为开展动物回归试验、生物学特性研究及疫苗研制等工作奠定基础，保护我国养猪业健康持续发展。