长链非编码RNA-lncRNA2在食管癌中高表达

杜雪莲， 张美英， 郭明洲

中国人民解放军总医院消化内科，北京 100853

食管癌是全球第七大常见的肿瘤，也是与癌症相关死亡的第六大主要原因[1]。由于食管癌早期症状不典型，尽管目前诊断方法和技术已有所进步，但大多数患者确诊时已属于晚期，不能进行手术切除治疗，其5年生存率约为15%[2]。 因此，寻找新的食管癌诊断标志物及治疗靶标有望提高早期诊断率和治疗效果，改善食管癌预后[2-3]。

随着人类基因组测序的完成，发现蛋白编码序列仅占整个基因组序列的2 %以下[4]，仅依据基因组序列的改变无法解释肿瘤等复杂疾病的机制。表观遗传在食管癌发生、发展过程中的作用和机制越来越受到人们的重视[5]， DNA甲基化在食管癌早期诊断、预后和化疗敏感性检测方面的研究已有大量报道[6-11]。非编码RNA，特别是长链非编码RNA (long non-coding RNA，lncRNA)在增殖、细胞周期、凋亡、分化、侵袭、迁移等生理和病理过程中发挥重要作用[12]。lncRNA在食管癌中的研究也有部分报道[13-15]。本文就lncRNA2在食管癌中的表达情况作一研究。

1 材料与方法

1.1 食管癌组织和细胞系从中国人民解放军总医院收集了43例食管癌及其距癌组织2 cm以上的配对正常癌旁组织。所有样品的收集均基于中国人民解放军总医院机构审查委员会的批准和指南。标本来源的所有患者术前均未接受任何放化疗等治疗手段。标本采集过程按照规范严格执行，获得患者知情同意。临床分期依据美国癌症联合委员会第8版食管癌TNM分期。在本研究中使用了14种食管癌细胞系，包括KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE450、KYSE520、COLO 680N、TE1、TE3、TE7、TE13、BIC1、YES2、HET细胞。所有细胞系均从原发性食管癌建立，并在质量浓度为100 mg/L胎牛血清和90% RPMI 1640培养基(Invitrogen，CA，美国)中培养。当在75 cm2的培养瓶(NEST Biotechnology，江苏，中国)中达到总汇合1×106个细胞时，细胞以1∶3传代。

1.2 RNA分离、逆转录和半定量RT-PCR使用Trizol试剂(美国生命技术公司)提取总RNA，通过分光光度计进行定量，并通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

根据制造商的说明(美国Invitrogen公司)合成了第1链cDNA。总共使用5 μg RNA合成第1链cDNA，并稀释至100 μl。随后，将2.5 μl稀释的cDNA混合物用于最终25 μl反应体积中的PCR扩增。lncRNA2的PCR引物序列如下：5′-GAGGCCAAATAGGTGGTTTCAGC-3′(F);5′-TGGCTTTCGCTC

TGGGACAT-3′(R)。 PCR扩增进行35个循环，产物长度为122 bp。 GAPDH的引物序列如下：5′-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(F)和5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(R)。作为内部对照，GAPDH扩增了25个循环，用质量浓度为2 g/L琼脂糖凝胶检查扩增的PCR产物。RT-PCR扩增条件为：95 ℃，5 min，1 cycle；95 ℃，30 s，64 ℃，30 s，72 ℃，40 s，3 cycles；95 ℃，30 s，61 ℃，30 s，72 ℃，40 s，3 cycles；95 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，40 s，3 cycles；95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，40 s，26 cycles。

1.3 lncRNA芯片技术博奥晶典公司的lncRNA表达芯片表达技术，覆盖NCBI、RNAdb、Refseq、UCSC Known、Gene等多个数据库。对14对配对的食管癌组织和癌旁组织进行分析，获得差异表达>10倍的lncRNA 134个。

1.4 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计分析。 食管癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、吸烟史、饮酒史、家族史与lncRNA2表达情况的关系用χ2检验进行分析,检验水准α=0.05；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA2在食管癌细胞系中表达明显增加lncRNA2在KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE450、KYSE520、COLO680N、TE3、YES2、BIC1细胞中高表达，在TE1、TE7、TE13、HET细胞中缺失表达,表明lncRNA2在食管癌细胞系中表达明显增加 (见图1)。

2.2 lncRNA2在食管癌组织中的表达明显增加在43对配对的食管癌及癌旁组织中， lncRNA2在26例癌组织中高表达，而在癌旁组织中缺失表达或低表达；11例在癌组织中缺失表达或低表达，而在癌旁组织中高表达，另外6例在癌组织和癌旁组织中均缺失表达(见图2)。

lncRNA2在60.47%(26/43)的食管癌组织中高表达，而在25.58%(11/43)的癌旁组织中高表达，差异有统计学意义(P<0.01)。

lncRNA2高表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、吸烟史、饮酒史、家族史等临床因素均无相关性(P均>0.05)(见表1)。

图1 lncRNA2在食管癌细胞系中的表达情况 Fig 1 The expression of lncRNA2 in esophageal

注：C：癌组织；N：癌旁组织。

Fig 2 The expression of lncRNA2 in esophageal cancer tissues

续表1

因素例数高表达(n=26)低表达(n=17)P值 有1376 无301911饮酒史1.000 有642 无372215家族史1.000 有1174 无321913

3 讨论

食管癌是我国常见的恶性肿瘤，其发病机制目前尚不清楚。尽管在肿瘤遗传方面进行了大量研究，但目前尚未发现食管癌相关的突变热点[16-19]。在表观遗传方面的研究发现，在食管癌的发生、发展过程中具有甲基化的累积性改变，且DNA甲基化与食管癌的预后和化疗敏感性密切相关[20-23]。关于lncRNA在食管癌中的研究报道较少，我们过去的研究发现,lncRNA gadd7在食管癌中通过与TDP-43的相互作用而调控Cdk6 mRNA的代谢[24]。我们通过lncRNA芯片技术筛选出一批新的在食管癌中异常表达的lncRNA。其中，lncRNA2定位于5号染色体， 其表达在食管癌中明显升高，其机制有待进一步研究。lncRNA2是食管癌潜在的诊断标志物和治疗靶标。