褐鳟LEAP-2成熟肽在大肠杆菌中的融合表达

刘晨斌 ，徐革锋，黄天晴，谷 伟，陈春生，程 琳，史秀兰，王炳谦*

（1.哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，哈尔滨 150025；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070；3.北京市水生野生动植物救护中心，北京 102100）

褐鳟营养与经济价值俱佳，是西藏亚东地区重点养殖鱼种[1]。近年来，西藏交通运输环境逐渐优化，促进褐鳟养殖业发展，但发病率持续升高[2]。为控制病害，抗生素等化学类药物大量使用，病原微生物对药物产生较强抗药性，且抗生素在水中残留污染水生环境[3]。抗菌肽具有广谱抗性，无残留，相对分子质量较小，不会导致耐药性，可有效替代抗生素。

肝脏表达抗菌肽2（Liver-expressed antimicrobial peptide-2，LEAP-2）产生于肝脏，随后进入血液，通过血液循环产生抗菌效果。Krause等最初通过分离人类血液，得到肝脏表达抗菌肽1（Hepcidin）和抗菌肽2，在抗微生物活性方面，LEAP-2更强，血液中形成长度不一的多肽，具有抗菌作用[4]。鱼类中LEAP-2 最早发现于虹鳟（Oncorhynchus mykiss），具有两种类型，分别为LEAP-2A和LEAP-2B[5]。至今已有较多鱼类LEAP-2基因被克隆鉴定，其中包括大黄鱼（Larimichthys crocea）[6]、斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）[7]、牙 鲆（Paralichthys olivaceous）[8]、蓝色鲶鱼（Ictalurus furcatus）[9]、草鱼（Ctenopharyngodon idella）[10]、日本鳗鲡（Anguilla japonica）[11]等。

褐鳟LEAP-2研究有助于了解该基因在褐鳟免疫系统中的作用，利于褐鳟健康养殖和野生资源保护。本研究克隆褐鳟LEAP-2基因，分析其分子特征，构建pET32a-mLEAP-2 重组表达载体对其原核表达，为进一步探究LEAP-2抗菌功能奠定基础，为褐鳟健康养殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

成年健康褐鳟（平均体长37～38 cm，体重700～750 g）取自黑龙江水产研究所渤海冷水性鱼试验站。经麻醉后迅速解剖，取肝脏组织约400 mg，置于1.5 mL 离心管，液氮迅速冷冻样品，转移至-80 ℃冰箱备用。

1.2 总RNA提取

采用Trizol 试剂（Invitrogen，美国），按试剂使用说明提取褐鳟肝脏组织总RNA（100 mg∶1 mL），1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，紫外分光光度计（Thermo Scientific，美国）测定总RNA浓度和纯度。

1.3 LEAP-2基因开放阅读框序列

采用同源克隆方法，通过Primer 5.0设计1对引物，L2-F：TGCAGGACCGTCAACACTAC，L2-R：GATGGGTTGGCTGAACATGC。以提取的褐鳟肝脏组织总RNA 为模板，利用反转录试剂盒BioRT Master HiSensi cDNA First Strand Synthesis Kit（博日科技有限公司，杭州）将其逆转录为cDNA，以L2-F和L2-R为引物PCR扩增。凝胶回收试剂盒TaKa-Ra MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4.0（TaKaRa，日本）对扩增目的片段回收、纯化，与pMD18-T 载体连接，转化至DH5α 感受态细胞，37 ℃过夜培养。对PCR检测为阳性菌落测序。

1.4 序列特征生物信息学分析

通过Blast 在线程序分析序列相似性，同时利用DNAman 9.0 软件将褐鳟LEAP-2 与多种动物LEAP-2 序列作多序列比对。比对动物包括：人（Homo sapiens，NP_443203.1）、猪（Sus scrofa，NP_998953.1）、牛（Bos Taurus，NP_776984.1）、小鼠（Mus musculus，NP_694709.1）、猕猴（Macaca mulatta，NP_001107582.1）、红 原 鸡（Gallus gallus，NP_001001606.1）、狒狒（Papio anubis，NP_00116 2235.1）、狗（Canis lupus familiaris，XP_852172.1）、大西洋鲑（Salmo salar，XP_014039283.1）、红点鲑（Salvelinus alpinus， XP_023996429.1）、虹 鳟（Oncorhynchus mykiss）LEAP-2A 型（NP_001117936.1）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）LEAP-2B 型（NP_0011179 37.1）、草鱼（Ctenopharyngodon idella）（ACR54299.1）、黄颡鱼（Tachysurus fulvidraco，XP_026990153.1）、长鳍真鮰（Ictalurus furcatus，AAX45792.1）、斑马鱼（Danio rerio，NP_001122249.1）、 大黄鱼（Larimichthys crocea，NP_001290271.1）、牙鲆（Paralichthys olivaceus，XP_019960564.1）以及斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus，NP_001187134.1）。

采用MEGA 5.0 构建上述物种LEAP-2 系统进化树。利用SignalP 3.0 预测褐鳟LEAP-2 信号肽序列。利用NetPhos 3.1 Server预测磷酸化位点；利用NetNGlyc 1.0 Server 和NetOGlyc 4.0 Server 分别预测N-糖基化位点和O-糖基化位点；利用ProtParam预测理化属性；利用SWISS-MODEL 和PredictProtein预测编码蛋白结构。

1.5 LEAP-2成熟肽融合表达质粒构建

设计一对含Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点引物，上游引物L2YH-F：CCGGAATTCATGACCCCGTTGTGGAGG（下划线表示含3个保护碱基+Eco RⅠ酶切位点），下游引物L2YH-R：CCGCTCGAGA TGTTTGGCTATGTAGAGGAGAGG（下划线表示含3 个保护碱基+XhoⅠ酶切位点），以褐鳟肝脏组织cDNA 为模板，PCR 扩增，扩增产物纯化后与pMD18-T 载体连接，转化至DH5α 感受态细胞，37 ℃过夜培养。对PCR 检测为阳性菌落作序列测定，序列正确菌落液体培养过夜，用质粒小提试剂盒Biospin Plasmid DNA Extraction Kit（博日科技有限公司，杭州）提取pMD18-T-mLEAP-2 重组质粒。用Eco R Ⅰ和Xho Ⅰ分别对pMD18-TmLEAP-2 和pET32a 质粒（丰晖生物，湖南）双酶切，将双酶切后纯化得到带有相同黏性末端成熟肽mLEAP-2 和pET32a 载体片段连接，转化DH5α感受态细胞，37 ℃过夜培养。将PCR 检测为阳性菌落过夜培养，提取质粒，对提取质粒双酶切鉴定。测序鉴定正确质粒，将测序正确质粒保存于-20 ℃。

1.6 LEAP-2成熟肽在大肠杆菌中表达

取1 μL pET32a-mLEAP-2 重组表达质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，37 ℃过夜培养。挑取阳性克隆，在含100 μg·mL-1氨苄青霉素LB液体培养基中过夜培养，按1∶100 比例扩大培养，37 ℃，120 r·min-1振摇培养至OD 约为0.5，取出3 mL 菌液作为阴性对照，其余菌液加入1 mol·L-1IPTG 使终浓度为0.25 mmol·L-1诱导其表达，继续培养6 h，每隔1 h 取样1 次，将收集菌液4 ℃10 000 r·min-1离心5 min，收集菌体，PBS洗1次，取菌体于5×SDS-PAGE上样缓冲液中，煮沸15 min裂解，裂解液作SDS-PAGE 电泳检测。含pET32a 空质粒的BL21（DE3）菌体作对照，处理条件与试验组相同。另收集诱导4 h菌体，PBS洗后超声破碎，离心后获得上清液和沉淀，SDS-PAGE电泳检测。

2 结果与分析

2.1 褐鳟LEAP-2基因开放阅读框序列的克隆

采用同源克隆方法，得到褐鳟LEAP-2的ORF序列，全长291 bp，编码96个氨基酸（见图1）。利用ProtParam 分析褐鳟LEAP-2 基本物理化学参数，分子式为C478H739N133O130S11，总原子数为1491个，相对分子质量为10.78 ku，理论pI 值为9.19，不稳定系数为63.71，亲水性平均系数为-0.123。SignalP 3.0 分析显示褐鳟LEAP-2 含有一个潜在信号肽序列，剪切位点位于Ala27和Ser28，自氨基端起1-27 残基为信号肽区域。功能位点分析显示褐鳟LEAP-2存在4个丝氨酸（Ser）和3个苏氨酸（Thr）磷酸化位点， 4 个O-糖基化位点（分别在第32、38、39 和62 位氨基酸位点），不存在酪氨酸（Tyr）磷酸化位点和N-糖基化位点。通过PredictProtein预测 显 示Cys-72 与Cys-78 和Cys-83 与Cys-88 之间分别形成2对二硫键。

预测褐鳟LEAP-2 三级结构，结果见图2。通过搜索发现，人类LEAP-2（PDB number:2l1q.1.A）与褐鳟LEAP-2 蛋白序列最匹配，序列一致性为41.03%，QMEAN 值为-1.61。从结构上看，褐鳟LEAP-2 与人类LEAP-2 相似，其中包括由2 对二硫键组成的紧密中心及无序N端和C端。

2.2 褐鳟与其他生物LEAP-2氨基酸序列比较

分析和比对褐鳟与其他物种LEAP-2氨基酸序列，发现褐鳟与大西洋鲑同源性最高，达99%；与模式鱼种斑马鱼同源性为55.2%；与红原鸡同源性为29.2%；与人类同源性为27.1%；与小鼠同源性最低，为22.5%（见表1）。

褐鳟与上述动物LEAP-2 比对结果见图3，在羧基端具有多个保守氨基酸残基，其中包括4个高度保守的半胱氨酸残基（星号标出），在这4个半胱氨酸残基之间形成2 对二硫键，2 对二硫键与LEAP-2 抗菌活性密切相关。

表1 褐鳟LEAP-2氨基酸序列的同源性分析Table 1 Homologous analysis of the amino acid sequence of brown trout LEAP-2

2.3 LEAP-2基因在不同物种间进化分析

通过MEGA 5.0 软件构建进化树（见图4），主要有两个分支，其中硬骨鱼类形成一个分支，鸟类和哺乳动物形成另一个分支，说明鱼类与哺乳动物和鸟类亲缘关系较远。在硬骨鱼类分支中，褐鳟与大西洋鲑亲缘关系最近，先形成一簇，再与其他鱼类成簇。除大西洋鲑之外，褐鳟与同为鲑科的虹鳟A型和红点鲑亲缘关系也较近。

2.4 pET32a-mLEAP-2重组表达质粒构建及鉴定

提取阳性菌落中的质粒，Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测后显示在约214 bp处可见目的片段条带（见图5）。测序鉴定正确质粒，测序结果证明目的片段“mLEAP-2”已成功连接到pET32a 表达载体，核苷酸序列未发生任何碱基突变。

2.5 LEAP-2在E.coli中体外表达

含重组表达质粒pET32a-mLEAP-2 大肠杆菌BL21（DE3）被培养至OD 值约为0.5 后，通过IPTG诱导，对诱导0、1、2、3、4、5、6 h 菌体总蛋白作SDS-PAGE 电泳分析，同时取诱导4 h 菌体，经超声破碎后将获得沉淀和上清分别作SDS-PAGE电泳分析。结果如图6所示，含重组质粒菌体总蛋白在相对分子质量约22.61 ku处有蛋白条带，与预期相符，而在含pET32a 空质粒菌体总蛋白上未见该条带，表明重组蛋白得到有效表达。另外，在菌体经超声破碎后离心得到上清和沉淀中均存在目的条带，表明trxA-mLEAP-2融合蛋白除以可溶性蛋白形式表达外，还存在于包涵体中。

3 讨论与结论

本试验克隆褐鳟LEAP-2基因ORF序列，分析其序列特征。通过对比分析发现，褐鳟与鸟类和哺乳类同源性均在30%以下，与草鱼等非鲑科鱼类和虹鳟LEAP-2B同源性40%～61%，与虹鳟LEAP-2A、红点鲑和大西洋鲑同源性均在94%以上，其中与大西洋鲑同源性最高，达99%。系统进化树显示结果也与上述分析相同，与分类上的亲缘关系一致，说明褐鳟LEAP-2在进化上相对保守。

该基因编码96个氨基酸，自氨基端起前27个氨基酸为信号肽部分，28～96个氨基酸为原前体肽部分，在Ala27和Ser28之间存在信号肽酶切位点；原前体肽由前体肽和成熟肽组成，在前体肽和成熟肽之间存在可被前体肽转化酶识别的切割位点（RMAR-MT）。4 个高度保守半胱氨酸在羧基端形成2 对二硫键并构成稳定β-折叠结构，更易穿过细胞膜杀死病原微生物[12]。研究证明，对昆虫防御素使用二巯苏糖醇还原分子内二硫键，其抗菌活性消失[13]。因此2 对二硫键与LEAP-2 抗菌活性有关。

目前LEAP-2体外表达已有报道，王红亮通过将小鼠LEAP-2 成熟肽cDNA 连入pPIC9 载体中，获得pPIC9-LEAP-2 重组质粒[14]。张虹等在对斑点叉尾鮰LEAP-2 基因全长cDNA 改造后，将其插入pET-32a载体，BL21菌表达和纯化获取目的蛋白，以Western blot检测进一步证实斑点叉尾鮰LEAP-2在大肠杆菌BL21中表达[7]。蔡灿等将大黄鱼LEAP-2全长cDNA连入pET-32a载体，在体外表达大黄鱼LEAP-2重组蛋白[6]。本试验以褐鳟LEAP为研究对象，构建pET32a-mLEAP-2重组表达质粒，表达后所得蛋白与预期相对分子质量一致，为22.61 ku，表明目的蛋白有效表达。

利用原核表达系统表达外源蛋白时，需注意外源蛋白对宿主菌“毒性”作用，避免“宿主菌自杀”[15]。因此本研究选择pET32a作为表达载体，目的基因在pET32a载体上转录和翻译受T7噬菌体信号控制，在加入IPTG后，大量T7 RNA聚合酶产生并与载体上T7 启动子结合，使目的重组蛋白高效表达；而未加入IPTG 时，目的基因无表达，宿主菌可良好生长。另外，在pET32a 载体上具有trxA标签，蛋白可正确折叠，有效改善其溶解性能，减少包涵体蛋白形成。

本试验克隆得到褐鳟LEAP-2基因ORF序列，并在体外成功表达“trxA-mLEAP-2”重组蛋白，为进一步研究褐鳟LEAP-2基因功能提供理论基础。