基于石墨烯纳米材料的DNA测序研究进展

郑梅琼，林佳敏，侯晓琳，聂 彤，黄晓欣，杨剑萍

(广东第二师范学院 化学系，广东 广州 510303)

DNA测序指分析特定DNA片段中的碱基序列即腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。碱基的排列顺序包含了大量的生物信息和遗传指令，不仅在基因诊断、基因治疗、揭示遗传信息、调控基因表达等基础生物学研究中发挥着重要作用，而且在国民经济、安全、军事、法律等诸多领域应用广泛。DNA测序是准确快速读取碱基序列的方法[1]。研发高效的DNA测序方法进行生物基因组数据分析，在早期疾病的诊断和治疗，了解相关疾病的病理，尤其是促进个体化医疗，最终达到预防疾病等方面具有非常重要的意义。

根据已报道的DNA测序方法，可以将其分为四代：第一代为荧光标记Sanger测序法[2-3]；第二代是循环阵列合成测序法[4]；第三代是单分子测序法[5]；第四代是纳米孔测序法[6]。与前三代基因测序技术相比,第四代基因测序技术在成本、速度、检测长度和仪器小型化等方面有着很大提高，并且实现了从光学检测到电信号检测的转变。基于纳米孔的测序技术是一种无标签、无放大、单分子的高通量DNA分析方法[1]，是目前最有前途和最具革命性的DNA测序技术之一，并且有望达到黄金标准以上的水平，具有价格低廉、可靠、通量高等特点。

石墨烯是单层碳原子，呈二维六角形格子状排列，具有原子薄，强度大，灵活度高，可拉伸和呈透明状，光学性能可调节，离子不可穿透等优点，同时还是优良的热导体和导电体[2]。其巨大的比表面积(高达2 630 m2/g)和独特的sp2杂化碳的蜂窝状晶格，使之成为生物分子锚定和检测的理想候选材料。除此之外，石墨烯特别适合DNA测序，因为单层石墨烯的厚度可以达到0.35 nm，与ssDNA中相邻核苷酸间的距离(0.32～0.52 nm)[7]相近。再者，石墨烯纳米孔的尺寸可以精确制作并调整到大约1.0 nm，近似于DNA分子的大小。理论研究表明，在合适的石墨烯中采用横跨膜电导的测序方法可以实现错误率为零的DNA测序[7]。石墨烯上述优异性能使之成为制备生物传感器的理想材料并广泛应用于DNA测序领域。本文侧重论述了近年来石墨烯纳米孔、纳米间隙、纳米带在DNA测序方面的最新研究进展(图1)。当DNA分子在外加电场的作用下穿过石墨烯纳米孔时，研究人员通过分析离子电流的变化可以获得碱基顺序(图1A)。石墨烯纳米间隙测序法则是利用石墨烯的导电性(图1B)，因为当DNA分子中的每个碱基流经石墨烯纳米间隙时会产生不同的隧穿电流。石墨烯纳米带测序法通过监控DNA分子通过孔隙时产生的不同的横向电流(图1C)进行测定。

图1 应用石墨烯纳米材料的DNA测序法[8]Fig.1 DNA sequencing methods using graphene nanomaterials[8]A.the modulations of ionic current by DNA molecule through graphene nanopore;B.variations in tunnelling current by DNA molecule through graphene nanogap;C.the changes of in-plane current by DNA molecule through graphene nanoribbon(A.DNA分子通过石墨烯纳米孔引起离子电流的变化；B.DNA分子通过石墨烯纳米间隙引起隧穿电流的变化；C.DNA分子通过石墨烯纳米带引起横向电流的变化)

1 石墨烯纳米孔测序法

石墨烯纳米孔测序法原理是基于DNA分子中的每个碱基以稍微不同的方式阻断离子电流通过石墨烯薄片上的微小纳米孔，即根据DNA分子碱基的大小和形状不同，产生不同的特征离子电流信号，从而检测DNA分子序列。方法是将带纳米孔的不渗透膜插入到两个独立的电解溶液池之间，对膜两侧施加电压，检测孔隙中的离子电流。由于DNA的磷酸骨架带有强烈的负电荷，因此可在电场存在下，使DNA以从头到尾的方式通过纳米孔。当DNA分子通过纳米孔道时，碱基会阻断离子的流通，形成阻断电流。每个阻断电流的倾角代表一个生物分子的通路，脉冲的大小和持续时间分别表示分子的半径和长度[9]。

利用石墨烯纳米孔进行DNA测序的优势在于，单层石墨烯的离子渗透能力很弱，并且由于其柔韧性，石墨烯可以形成独立的膜，促进理想原子薄膜形成。由于经过离子筛选后，溶液中石墨烯的有效厚度仅约0.6 nm，这与单链DNA分子中两个相邻碱基之间的距离(约0.6 nm)相同[8]，因此单层石墨烯的感测分辨率具有达到理论最优的潜力。另一方面，石墨烯具有优良的导电性，可以实时监测DNA分子通过孔隙的电流。英国Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司推出了实时快速检测DNA和RNA的便携式测序仪MinION[10]。该仪器由一个传感器芯片、专用集成电路和适配器组成。该仪器主要是通过测量DNA片段通过纳米孔时产生的电导率变化来识别DNA碱基。由于纳米孔道在同一时间内含多个碱基，且该装置系统误差较大，进而导致测定结果准确率降低。但在石墨烯纳米孔隙的体积中离子信号只源于一个或几个相邻的碱基，因此信号处理可高度简化。

研究人员对离子电流通过石墨烯纳米孔以用于DNA测序的可行性进行理论研究[11-12]，利用分子动力学模拟DNA分子通过石墨烯纳米孔的运动，以便确定离子电流影响DNA测序的方式。早期的研究发现，在1 V的偏置电压下石墨烯纳米孔可以区分聚AT碱基对和聚GC碱基对，但同时也发现了以下问题：DNA分子中每个碱基通常以0.01～1.00 μs的速度穿过孔隙，其速度太快，且易受到离子电流中高噪声的限制[13]，这导致电流阻塞，出现强烈的信号重叠，致使无法区分每一个碱基。因此，理想的DNA测序应该是找到一种方法来控制ssDNA通过纳米孔道的速度。Shankla等[14]采用全原子分子动力学(MB)方法，发现在中性电荷膜中，ssDNA的平均移位速度为0.06 nt/ns，且通过纳米孔道的速度随着电荷密度的增加而增加，在电荷密度1 e/nm2时达到0.25 nt/ns。Shankla采用带正电荷(电荷密度为1.5 e/nm2)的三层石墨烯膜，在500 mV的偏置电压下，观察到约7个核苷酸通过纳米孔，当膜电荷密度为-1.5 e/nm2时，核苷酸停止通过纳米孔道[14]，即膜的负电荷密度抑制了ssDNA通过纳米孔道。故石墨烯电荷可以控制ssDNA通过纳米孔的速度。Avdoshenko等[15]采用分子动态模拟和电子传输计算，确定了电场强度和通过纳米孔道时间的关系，证实石墨烯纳米孔对DNA核酸碱基具有选择性(图2)。这表明DNA的存在会给沿纳米孔轴分布的静电势带来微小的扰动并且这个扰动与核酸碱基通过孔道的时间以及种类有关。

图2 DNA分子通过石墨烯纳米孔的装置图(A)和俯视图(B)[15]Fig.2 Schematic(A) and the top view(B) of DNA molecule through graphene nanopore device[15] the arrow shows how DNA molecule is rotated on the core of the nanopore(箭头表示DNA分子在纳米孔中心的旋转情况)

ssDNA构象与石墨烯膜电荷的符号和大小以及DNA链的核苷酸组成密切相关。在电中性石墨烯中，ssDNA的碱基在石墨烯表面上呈平面构象。膜电荷密度在0～-2 e/nm2范围内，DNA的磷酸骨架和负电荷石墨烯表面之间的静电斥力占主导地位。膜电荷密度为+2 e/nm2时，ssDNA碱基与石墨烯平面形成约47°角，而磷酸骨架仍然平躺在石墨烯平面上[14]。ssDNA分子由平面构象转变为倾斜构象的动力为静电作用：带负电的磷酸骨架与带正电的石墨烯纳米层相互吸引，导致碱基倾斜，而碱基倾斜有利于偶极矩的静电能降至最低[14]。除此之外，Shankla还发现胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、甲基化胞嘧啶和腺嘌呤核苷酸的均聚物在相同电荷密度的石墨烯表面呈现不同的构象[14]。

石墨烯薄膜具有柔韧性，这意味着可以使用电子束在悬浮的石墨烯薄片上雕刻纳米孔。然而，利用石墨烯纳米孔进行DNA测序，还需要解决很多基础性问题。第一，虽然完整的石墨烯薄膜与含有纳米孔的薄膜相比，其离子渗透率可以忽略不计，但其值不是零，即不同阳离子的离子渗透率不同，因此需考虑电解质-石墨烯的相互作用。第二，有关石墨烯纳米孔维度的问题，一般认为该孔是一个有限长度的圆柱体(电导与直径的平方成正比)，但其却是一个无限小的圆形孔径(电导与直径成正比)。第三，根据实验中要进行穿孔实验的单链DNA或双链DNA，明确特定纳米孔的直径范围以及精确制备纳米孔。此外，还涉及如何降低电流噪声，提高信噪比的问题，以及在不增加其他噪声的情况下，降低DNA通过纳米孔道的速度等。

2 石墨烯纳米间隙测序法

石墨烯纳米间隙测序基于DNA分子中的每个碱基流经石墨烯纳米间隙时的隧穿电流不同进行测定[16]。隧穿电流通过纳米间隙电极检测DNA的方法是：测量穿过两个紧密间隔的石墨烯纳米间隙电极的隧穿电导，监测当DNA分子通过狭缝时电流的变化。当碱基分子能级落在两个电极的偏置电压内时，可观察到独特的隧穿电流。除此之外，石墨烯可以同时代表膜和电极，并且纳米孔和电极在同一平面上会自动对准，故可大大减少器件制备的工作。

Zhang等采用密度泛函理论-非平衡格林函数(DFT-NEGF)研究了锯齿状石墨烯纳米带的间隙，发现石墨烯纳米窄带具有完美曲折边缘的纳米结构，可用于预测并鉴别不同碱基[17]。但另一项研究表明，由于碱基的旋转可能会发生量子干涉效应[18]，导致DNA碱基的离散能量状态和石墨烯电极的连续能态之间能量耦合而引起Fano型共振，故只有鸟嘌呤可以与腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶区别开来。

图3 飞秒激光照射石墨烯纳米间隙诱发产生亚循环电子脉冲示意图[22]Fig.3 Schematic of femtosecond laser irradiate the graphene nanogap inducing subcycle electron pulse[22]

隧穿电流对距离和方向的变化具有指数敏感性，科学家们预期隧穿电流会发生大幅波动[7,18-20]。虽然，4个DNA碱基隧穿电流的预测分布较宽(多个数量级的变化)，但几乎没有重叠，因此，通过氢化或附着其中一个核碱基功能化的石墨烯纳米间隙电极，可以维持分子的最优取向，从而显著减少电流波动。钝化电极边缘可促进偶联[20-21]，减慢DNA通过纳米间隙的速度，从而获得更多测量单独碱基的时间。Son等[22]发现，使用近红外飞秒激光脉冲照射石墨烯纳米间隙可产生亚循环电子脉冲(图3)，有助于高损伤阈值和可调的设备研发。这种“识别隧穿”意在减缓DNA通过间隙的速度。因此，可以在电场驱动下通过纳米间隙提取DNA序列信息。

目前利用石墨烯纳米间隙电极来处理单个分子[23-24]已有报道，其中最大的挑战是电极间的间隙要足够小。Bellunato等[25]利用两个扭曲的石墨烯纳米电极，探究隧穿电流特性，分析隧穿电流与纳米间隙电极的关系。他们发现电压和电流的关系曲线呈现s形，且这个形状是电子穿过势垒隧穿的一个显著特征，势垒高度由功函数决定，势垒宽度由石墨烯边缘之间的距离决定。除此之外，Bellunato等还探究了纳米电极从隧穿系统转变为点接触系统时的特点[25]：将纳米电极紧密地连接在一起，电子传递就会从隧穿系统转变为接触系统，这种扭曲的结构会导致纳米电极两端交点处的单个碳原子之间产生初始接触。在0.1 V偏置电压下，当隧道系统过渡到点接触系统时，可以观察到电流在约3 μA处扭结，并由此开启点接触系统。若电极进一步接触，则产生的电流会近似线性增加。若此时开始收缩纳米电极恢复真空间隙状态，则可观察迟滞现象。

虽然石墨烯的状态密度低，隧穿电流小，碱基波动(位置和取向)大，离子和水分子的布朗运动会产生额外噪音，但是，已有的理论研究以及成功制备的纳米间隙电极都为利用石墨烯纳米间隙电极进行DNA测序奠定了良好的基础。

3 石墨烯纳米带测序法

石墨烯纳米带测序法依据DNA分子内不同的碱基穿过石墨烯纳米带时的横向电流不同达到DNA测序的目的。横向电流通过纳米带的检测原理是：在石墨烯纳米带上钻出纳米孔，核苷酸在外电压的驱动下通过纳米孔，引起纳米孔周围局部状态密度的改变，从而可以检测到石墨烯纳米带上横向电流的改变[26]。这种方法的优点是可以检测到相对大的电流强度(μA)和高兆赫的平频响应，促进高带宽测量。Traversi等[27]利用纳米带上的电流和静电电势变化与DNA的有效横截面积成正比来检测DNA分子。Heerema等[28]使用定制的差分电流放大器区分电容电流信号和石墨烯电阻响应，证明DNA通过纳米带时，在横向电流中可以观察到电阻变化。前期研究表明，磷酸骨架会产生系统噪声，而分析多个纳米带之间的相互关系可能会减少并消除系统噪声，以及DNA流经纳米带而引起的热液波动[29]。Mcfarland等[30]运用密度函数理论和非平衡格林函数方法，确定了腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的透射谱和电流谱，以用于区分DNA/RNA测序的各种碱基。故不同的碱基与石墨烯纳米带的耦合强度不同，表现为不同碱基的横向电流不同。

虽然石墨烯是无间隙半导体，但其性能会随边缘轮廓的变化而改变。理论模拟显示，扶手椅型纳米带具有半导体性质，而锯齿状的纳米带则具有金属的性质且边缘电流曲线达到峰值，这种特性大大简化了测序仪的制造。横向电流比离子电流和隧穿电流大得多，但电阻却比纳米孔和纳米间隙小得多[1]，因此，可以在更高的带宽下进行测量，这意味着人们能够以更快的速度测量DNA序列，甚至可能是正常DNA分子通过纳米带的速度。Nelson等[31]分别在有无DNA链的情况下对状态密度进行积分，成功计算出扶手椅型纳米带的电流，结果表明该石墨烯纳米带测序装置可以区分4个不同的碱基，并且发现横向电流对链的取向不敏感。Paulechka等[26]利用石墨烯的电子特性，有效地结合沃森-克里克碱基互补配对功能化石墨烯纳米带(图4)。当DNA碱基与石墨烯纳米带官能团互补时，原子分子动力学模拟预期会形成氢键。由于DNA-石墨烯纳米带局部结合，石墨烯纳米带将被拉上并向平面外偏转，然后在达到氢键断裂所需的临界力时恢复。故可以根据石墨烯纳米带暂时性偏转引起的电流变化来检测碱基。

图4 核酸碱基功能化石墨烯纳米带边缘示意图[26]Fig.4 Schematic of nucleobase-functionalized the graphene nanoribbons[26]

了解石墨烯纳米带在水溶液中的聚合行为对于预测石墨烯纳米带与DNA分子的相互作用至关重要。Wijeratne等[32]发现有些石墨烯纳米带的力曲线只有一个力峰，有些则有多个力降和力峰。力曲线上的这些特征可能是受石墨烯纳米带中褶皱、环状、螺旋或其他变形的影响。石墨烯纳米带与蛋白质、DNA等生物聚合物具有相似的力伸长行为，其硬度随着化学功能的降低而增加。石墨烯纳米带由于和dsDNA具有生物相容性，可能形成与dsDNA(如双螺旋)相似的构象。鉴于dsDNA和蛋白质的构象不同，石墨烯纳米带在受到外界机械力作用时，可能包含不同的构象变形。

4 结论与展望

本文综述了石墨烯纳米孔、纳米间隙、纳米带在DNA测序领域中的最新研究进展，为DNA测序研究提供了前沿的、有价值的参考。

尽管基于石墨烯纳米技术的DNA测序技术已经取得了令人瞩目的成果，但仍面临许多挑战：(1)DNA通过石墨烯纳米孔道的速度太快，导致无法从电流放大器中提取每个碱基的信息；(2)DNA分子和石墨烯具有亲水作用，容易产生强烈的吸附效果；(3)电流的信噪比低；(4)石墨烯的几何形状不稳定，难以实现百分之百的复制重现。因此，DNA测序关键技术的突破将取决于上述难题的攻克。我们相信，在不久的将来，通过高速、可靠的DNA测序技术革命，借助DNA序列可视化等有力工具，将实现早期的疾病诊断和治疗，以及了解相关遗传疾病的机理，并且有望开发个性化基因组药物和探索药物输送等。