HPLC-MS/MS法同时测定动物源性食品中9种吡咯里西啶类生物碱的含量

姜 冰，丁 涛，曹崇江，宁晓盼，吴 斌，唐茂芝，王茂华

(1.中国药科大学 工学院，江苏 南京 211198；2.南京海关动植物与食品检测中心，江苏 南京 210001；3.国家市场监督管理总局认证认可技术研究中心，北京 100020)

吡咯里西啶类生物碱(Pyrrolizidine alkaloids,PAs)是广泛存在于植物中的含氮碱性化合物，可引起人和牲畜的肝毒性，尤其是PAs的代谢活化产物具有肝脏损伤、致癌和致发育等多种毒性作用[1-2]。PAs对哺乳动物本身并无明显毒性，当肝脏的正常氧化解毒机制将其转化为吡咯代谢产物(脱氢生物碱)时，它们作为食物或饲料成分时的危害开始产生[3]。因此，PAs的中毒案例时有发生。动物源性食品如蜂蜜、牛奶、鸡蛋和动物内脏很容易含有PAs，蜂蜜中检出PAs在国内外均有报道[4-7]。Bodi等[8]在中草药和茶叶中检出较高含量的PAs，但对于动物源性食品中是否含有PAs及其含量检测的研究仍较为缺乏。

对于PAs的检测方法通常有分光光度法[9]、薄层色谱法[10]、核磁共振法[11]、免疫学方法[12]、高效液相色谱法[13]、气相色谱-串联质谱法[14]、高效液相色谱-串联质谱法[15]等。分光光度法和薄层色谱法对复杂基质中PAs的痕量分析缺乏敏感性和选择性；气相色谱法也存在热分解不稳定等不足；而免疫学方法通常只对结构上紧密相关的一小部分PAs敏感[16]。随着液相色谱-质谱仪器检测能力的不断提高，该联用技术在天然产物分析中的应用日益广泛，极大地有助于对复杂基质中痕量天然产物的明确识别和定量，被应用于多种PAs的同时检测[17-19]。近年来，陆续有研究人员通过固相萃取净化/液相色谱-串联质谱法开展PAs的检测分析[20-22]。

本文通过MCX固相萃取柱净化，液相色谱-质谱/质谱法测定，建立了同时定量测定蜂蜜、乳制品、动物内脏等动物源性食品中倒千里光碱、野百合碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱、克氏千里光宁碱、立可沙明碱、天芥菜碱、毛果天芥菜碱、蓝蓟定9种PAs(如图1所示)含量的方法，并进行系统的方法学考察和实际样品分析。该方法具有样品制备简单和用量少、所需试剂少、灵敏度高、稳定性好等特点，可实现动物源性食品中PAs的快速和高效准确测定。

图1 9种PAs的分子结构式Fig.1 Molecule structures of 9 PAs

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

AB Sciex QTRAP 4500 LC-MS/MS系统(美国AB SCIEX公司)，Smart N15VF超纯水系统(力康生物公司)，WH-3微型涡旋混合仪(上海沪西公司)，SIGMA 2-16PK型高速冷冻离心机(北京博励行公司)，MSE 125P型分析天平(德国Sartorius公司)，KH-500SP双频数控超声波清洗器(禾创超声公司)，SPE432型全自动固相萃取仪(普立泰科公司)，Auto Vap s60型氮吹浓缩仪(美国ATR公司)。

甲醇(色谱纯，美国Honeywell公司)；甲酸、乙酸铵(色谱纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司)；MCX固相萃取柱、HLB固相萃取柱(3 mL/60 mg，Waters公司)。

标准物质：野百合碱(纯度100%)、立可沙明碱(纯度100%)、倒千里光碱(纯度99.8%)、天芥菜碱(纯度90.98%)、千里光菲灵碱(纯度99.78%)、千里光宁碱(纯度100%)、蓝蓟定(纯度96.62%)、克氏千里光宁碱(纯度97.16%)、毛果天芥菜碱(纯度98.4%)均购于上海安谱实验科技股份有限公司。用甲醇将各生物碱标准品溶解，稀释并定容获得1 mg/mL标准储备液，根据需要用甲醇将其储备液稀释至10 μg/mL作为中间工作储备液。

1.2 实验部分

1.2.1 蜂蜜样品的提取称取2 g(精确至0.01 g)试样置于50 mL带盖聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL 0.05 mol/L盐酸提取溶液，加入1 mL三氯甲烷去蛋白，涡旋混合均匀，8 000 r/min离心3 min，取上清液准备净化。

1.2.2 乳制品样品的提取称取5 g(精确至0.01 g)样品置于50 mL带盖聚四氟乙烯离心管中(乳粉样品加入5 mL水)，加入10 mL 5%三氯乙酸，涡旋混合均匀，8 000 r/min离心3 min，过滤(定性滤纸)后准备净化。

1.2.3 动物肝脏样品的提取称取1 g(精确至0.01 g)样品置于50 mL带盖聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL 1%乙酸乙腈，涡旋混合均匀，超声提取20 min，8 000 r/min离心3 min，过滤(定性滤纸)后准备净化。

1.2.4 样品净化将上述待净化样品转移至Waters Oasis MCX固相萃取柱(预先用5 mL甲醇和5 mL水活化)中，弃去废液，依次用5 mL水和3 mL甲醇淋洗，加入5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于40 ℃下氮气吹干，用1.0 mL甲醇-水(1∶9，体积比)溶液复溶，过0.22 μm滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

1.2.5 色谱参数色谱柱：Phenomenex Kinetex C18(4.6 mm× 100 mm，2.6 μm)；流动相：甲醇(A)-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵(B)；流速：0.5 mL/min；进样量：20 μL；柱温：40 ℃；流动相梯度洗脱程序：0～3.5 min，10% A；3.5～6.5 min，10%～90% A；6.5～10.0 min，90% A；10.0～10.1 min，90%～10% A；10.1～13.0 min，10% A。

1.2.6 质谱参数离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描模式：正离子扫描；监测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压(IS)：5 500 V；雾化气压力(GS1)：379 kPa(55 psi)；气帘气压力(GS2)：379 kPa(55 psi)；辅助气压力(CUR)：241 kPa(35 psi)；离子源温度(TEM)：550 ℃；其它质谱参数如表1所示。

表1 9种PAs的质谱参数Table 1 MS parameters of 9 PAs

*:quantitation ion

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

PAs的化学结构为含氮的碱性环状结构，因此采用C18反相色谱柱，正离子多反应监测(MRM)模式进行分离和测定。本文考察了4种不同流动相(甲醇-5 mmol/L乙酸铵、甲醇-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵、乙腈-5 mmol/L乙酸铵、乙腈-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵)的分离效果。实验结果显示使用甲酸酸化的水相体系可使峰形更尖锐，峰形改善明显。由于使用甲醇配制PAs标准溶液，因此选择甲醇做流动相的分离效果优于乙腈。本文最终选择甲醇-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵作为流动相。按“1.2.5”进行梯度洗脱，9种PAs标准溶液(200 μg/L)的总离子流图及各PAs的选择离子流图如图2所示。

2.2 质谱条件的考察

对PAs标准溶液分别进行稀释，并采用流动注射方式在正离子模式下进行母离子全扫描，确定分子离子峰，再分别以待测化合物的分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描。选择两个特征子离子，其中以信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定量离子对。以多反应监测正离子模式优化各种质谱参数，获得的最佳质谱参数见表1。

图2 9种PAs标准溶液(200 μg/L)的总离子图及选择离子流图Fig.2 Total ion and selected ion chromatograms of 9 PAs standard solutions(200 μg/L)

图3 不同固相萃取柱对9种PAs的净化效果Fig.3 Purification results of 9 PAs by different solid phase extraction columns

2.3 提取条件的选择

考察了不同溶剂对不同基质的去蛋白效果以及不同体积提取液的提取效果。对于蜂蜜基质，三氯甲烷的去蛋白效果明显优于5%三氯乙酸，而乳制品采用5%三氯乙酸的去蛋白效果较好，对于动物肝脏，提取液1%乙酸乙腈本身具有去蛋白效果，因此无需另加三氯甲烷或三氯乙酸去蛋白。测试了不同提取液体积(5、10、15 mL)对基质的提取效果，结果表明，采用5 mL提取液进行提取时，PAs的回收率较低，由于15 mL和10 mL提取液的回收率差别不大，为了减少提取溶液的使用量，最终选择10 mL提取液。

2.4 固相萃取净化的选择

液相色谱-质谱/质谱法进行定量测定时，通常采用液-液萃取、固相萃取等净化方式降低背景干扰，减少基质效应，提高检测结果的准确性。本实验考察了基于改性聚合物固相萃取柱(Waters Oasis HLB，60 mg/3 mL)和强阳离子固相萃取柱(Waters Oasis MCX)两种类型固相萃取柱的净化效果，在0.05 mol/L盐酸溶液中加入混合标准溶液并转移至活化的固相萃取柱，HLB小柱通过5 mL水淋洗，5 mL甲醇洗脱的方式进行净化，MCX小柱通过水和甲醇一次淋洗，5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱的方式进行净化。结果如图3所示，天芥菜碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱、克氏千里光宁碱、毛果天芥菜碱、蓝蓟定在两种固相萃取柱的回收率均大于70%，然而野百合碱、立可沙明碱和倒千里光碱在采用HLB固相萃取柱时净化回收率小于60%。此外，由于PAs在酸性条件下其叔胺基团易形成阳离子，因此，最终采用强阳离子固相萃取柱(Waters Oasis MCX)进行富集和净化。

2.5 基质效应

基质效应对待测组分在仪器中的响应信号会有不同程度的抑制或增强，使检测方法的检出限、定量下限和精密度等受到影响[23]。本文采取提取后添加法考察了蜂蜜、乳制品及动物肝脏中基质抑制效应的影响程度，基质效应(ME)计算如下：ME=A/B×100%，其中A为空白基质中标准物质的峰面积，B为甲醇中标准物质的峰面积。基质抑制时，ME<1；基质增强时，ME>1。实验结果表明，9种待测生物碱在蜂蜜、乳制品和动物肝脏基质中的ME为0.42～0.83。为消除基质效应的影响，本实验采用基质匹配标准工作溶液外标法进行定量，即样品溶液和标准溶液均采用空白样品的提取液作为稀释液，使其均具有相同的离子化条件。

2.6 线性关系、回收率与定量下限

在基质溶液中添加混合标准工作液，使其质量浓度分别为0、10、20、50、100 ng/mL，在优化实验条件下考察了9种PAs的线性关系。结果显示，9种PAs在0～100 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好(r>0.99)。以信噪比(S/N)大于3为方法检出限(LOD),信噪比(S/N)大于10且回收率和精密度较好的最低加标浓度为方法定量下限(LOQ)，得到9种PAs的LOD均为3 μg/kg,LOQ均为10 μg/kg。对洋槐蜜、麦卢卡蜂蜜、液态乳、乳粉及鸡肝等动物源性食品分别进行3个水平(10、20、50 μg/kg)的加标回收率测定，每个水平平行测定6次。由表2可知，9种PAs在不同加标水平的回收率为71.0%～103%，相对标准偏差(RSD)为3.0%～9.8%。不同品种的蜂蜜加标回收率有所不同，麦卢卡蜂蜜相对洋槐蜜的加标回收率较低；对于乳制品，液态乳的加标回收率相对高于固态奶粉的回收率。同种基质中不同PAs的加标回收率也有区别，譬如，在洋槐蜜中千里光宁碱和蓝蓟定的加标回收率相对较高。

表2 5种不同种类基质中9种PAs的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of nine PAs spiked in 5 kinds of samples(n=6)

the number denoted was the same as that in Table 1

2.7 实际样品的分析

采用本方法对21种蜂蜜、16种乳制品和3种动物肝脏中的9种PAs进行检测。结果发现，大部分样品均未检出或检出含量较小，而在麦卢卡蜂蜜中检出立可沙明碱、天芥菜碱、千里光菲灵碱、蓝蓟定和毛果天芥菜碱，含量为3.4～8.9 μg/kg。

3 结 论

本文通过酸性溶液提取，MCX固相萃取柱净化，液相色谱-质谱/质谱法检测，外标法定量，实现了对蜂蜜、乳制品、动物内脏等动物源性食品中9种PAs含量的同时测定。该方法具有样品与试剂用量少、操作简单、灵敏度高、重复性好等特点。选取的基质对方法虽具有一定干扰，但使用基质匹配标准曲线法后，回收率高，适用于蜂蜜、乳制品、肝脏等动物源性食品中9种PAs的测定。