高效液相色谱-质谱法测定牛Ⅰ型胶原含量

邢芳毓，高建萍，张贵锋*，王明林*

(1.山东农业大学 食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；2.中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室，北京 100190)

胶原是哺乳动物体内最丰富的蛋白质，对于维持组织的机械稳定性具有重要作用[1-3]。目前已发现的胶原有29种[4]，均为3条肽链组成的右旋三螺旋结构，且三螺旋结构区域内的肽链由规则重复的每2个氨基酸出现1个甘氨酸的序列组成。胶原作为细胞外基质的主要成分，其相互交联成网状结构并与其它蛋白及多糖类结合，以给予细胞和组织一定的机械强度和支撑。胶原具有低免疫原性、生物相容性、止血性和可生物降解性等生物性能，使其在生物医学中成为最常用的材料之一，如药物输送系统、伤口敷料、皮肤、血管等产品[5-8]。因此，在胶原相关的研究中，胶原的定量分析成为产品研发及质量控制的关键。

目前胶原的定量方法众多，如毛细管电泳法[9]、比色法[10]、高效液相色谱法[11]和免疫学检测法[12]等，但在定量的准确性等方面均存在一定局限性。例如，基于羟脯氨酸的定量方法，只能测得总胶原含量，无法区分不同类型胶原；酶联免疫吸附测定法要求样品为中性溶液，但大部分胶原为酸溶性，中性条件下几乎不溶，极大地影响检测的准确度；利用免疫荧光染色定量组织中的胶原，需进行组织切片，而Ⅰ型和Ⅲ型胶原在皮肤真皮层中分布不均匀[13]，另外该方法利用图像软件分析染色结果，准确度较低，误差较大。

离子阱质谱具有多级质谱功能，可以分析化合物结构，对多肽的序列进行识别[14]。不同物种、不同类型胶原的氨基酸序列彼此不同，可用液相色谱-质谱联用技术识别出不同类型胶原中的特征多肽，从而实现胶原的类型识别[15]。三重四极杆质谱同样可用于结构分析，其比离子阱质谱灵敏，更适用于微量物质的定量分析[16]。胰蛋白酶降解过程中胶原的断裂具有一定规律性(胰蛋白酶的酶切位点在精氨酸或赖氨酸的羧端)，在相同的酶解条件下，可根据特征肽段的序列进行胶原定量。本文基于高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术，在比较不同类型的牛胶原氨基酸序列的基础上，筛选出牛Ⅰ型胶原的特征肽段，并利用特征肽段对市售胶原海绵样品中的牛Ⅰ型胶原进行定量，为胶原的准确定量提供了方法依据。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

液相色谱-离子阱质谱由1100液相色谱(美国Agilent公司)和LCQ DecaXP电喷雾质谱(美国Thermo Fisher公司)组成；高效液相色谱-三重四极杆质谱由U3000液相色谱、TSQ Quantum ACCESS MAX质谱(美国Thermo Fisher公司)组成；数据采集与处理软件为Xcalibur1.3。

1.2 材料与试剂

牛Ⅰ型胶原海绵(河北考力森生物科技有限公司)；胰蛋白酶(序列纯，猪源，Promega公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，Merck公司)；甲酸(色谱纯，Aladdin公司)；GFSGLDGAK特征肽段标准品(纯度为99.28%，上海强耀生物科技有限公司)；碳酸氢铵(NH4HCO3，分析纯，西陇科学股份有限公司)。

1.3 样品前处理条件

取胶原海绵样品10 mg加入10 mL NH4HCO3缓冲液(0.05 mol/L)，于沸水浴中加热20 min，待冷却至常温后，加入胰蛋白酶(200 μg)，37 ℃酶解16 h，再于沸水浴中加热5 min使胰酶灭活，离心(10 000 r/min)10 min，待上样。

1.4 凝胶过滤分析条件

色谱条件参考文献方法[17]。

1.5 液相色谱-离子阱质谱联用分析条件

1.5.1 色谱条件色谱柱：Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)；流动相：A为水(0.1%甲酸)，B为乙腈(0.1%甲酸)；洗脱梯度：0～5 min，5% B；5～40 min，5%～40% B；40～80 min，40%～75% B；流速：0.2 mL/min；进样量：10 μL。

1.5.2 质谱条件ESI电离；喷雾电压：4.5 kV；鞘气流速：约400 kPa(60 arb)；扫描范围(m/z)：300～2 000；正离子监测模式；精确质量数扫描(Zoom scan)和二级质谱扫描(MS/MS)均为数据依赖性扫描；二级质谱的碰撞能量为35%。

1.6 液相色谱-三重四极杆质谱联用分析条件

1.6.1 色谱条件色谱柱：Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm,5 μm)；流动相：A为水(0.1%甲酸)；B为60%乙腈+40%水(0.1%甲酸)；洗脱梯度：0～25 min，5%～50% B；25～26 min，50%～90% B；26～35 min，90% B；35～36 min，90%～5% B；36～45 min，5% B；流速：0.2 mL/min；进样量：10 μL。

1.6.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：选择离子监测(m/z851.4)；喷雾电压：3.5 kV；鞘气压力：241.3 kPa；辅助气压力：约1.2 kPa(8 arb)；鞘气辅助气压力：0.6 MPa；离子传输管温度：270 ℃;离子源蒸发温度：100 ℃。

1.7 水分与炽灼残渣测定

按照《中华人民共和国药典》[18]中0832和0841规定的方法进行。

图1 胶原海绵酶解产物的总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram of digested collagen sponge

2 结果与讨论

2.1 牛Ⅰ型胶原特征多肽的筛选

胶原海绵样品经序列纯胰蛋白酶酶解后产生大量有断裂规律的低分子量多肽，将酶解后样品用离子阱质谱(LCQ)进行分析，得到牛Ⅰ型胶原酶解多肽的总离子流图(图1)。利用BLAST进行胶原多序列比对，发现牛Ⅰ型胶原存在一定数量的特征多肽。利用Bioworks软件对质谱信息用SEQUEST进行数据库搜索，多肽筛选参数为Xcorr>1.5(单电荷)，Xcorr>2.0(双电荷)，筛选出的阳性肽段见表1。然后结合手工检查确认谱图质量，例如离子丰度、b离子和y离子之间匹配度等。同时确保肽段短小，羟基化修饰位点低。依据以上条件，筛选出多肽GFSGLDGAK为牛Ⅰ型胶原的特征肽段。图2和图3分别为该肽段的提取离子流图和质谱图，该肽段的提取离子流图有较高的丰度，且二级离子碎片与理论值的匹配度较高。故选择该肽段为牛Ⅰ型胶原的特征肽段，用于牛Ⅰ型胶原的类型识别与定量。

表1 牛Ⅰ型胶原的阳性肽段信息Table 1 Positive peptide information of bovine Ⅰtype collagen

P*is hydroxyproline

图2 特征肽段的提取离子色谱图和一级质谱图Fig.2 Extracted ion chromatogram and mass spectrum of marker peptide

图3 特征肽段的二级质谱图Fig.3 MS/MS spectrum of marker peptide

2.2 样品前处理分析

胶原海绵样品经过2次沸水浴加热前处理，一次是酶解前加热使胶原解旋变性，另一次是酶解后加热使胰酶灭活。本研究利用肽段对胶原进行定量，需确保除酶解释放肽段外，其他步骤不会发生肽键断裂。对不同相对分子质量的蛋白标准品以及胶原海绵经沸水浴加热20 min后的样品进行凝胶过滤分析，凝胶过滤色谱图分别见图4A和4B。由图4A中不同蛋白标准品的相对分子质量与对应的保留时间计算得出，图4B中2个色谱峰的相对分子质量分别约为276 kDa与138 kDa。文献研究显示，加热后胶原变性，三螺旋解旋形成明胶，3条肽链完全松开或1条肽链松开，任意2条肽链由少量氢键连接，牛I型胶原的单条肽链相对分子质量为138 kDa(UniProtKB)，这与本文的凝胶过滤检测结果符合。同时图4B中无其他杂峰，表明短时间的加热并未使胶原肽链破碎，未产生低分子肽段。酶解后，利用“1.6”方法对未加热灭活和加热灭活的样品进行检测(图5)，特征肽段的峰面积相似，酶解肽未因加热而导致进一步水解。

图4 蛋白标准品(A)与胶原海绵样品(B)的凝胶过滤色谱图Fig.4 Gel filtration chromatograms of protein standards(A) and collagen sample(B)A.1:430 kDa,2:200 kDa,3:150 kDa,4:69 kDa,5:29 kDa;B.1:276 kDa,2:138 kDa

图5 特征肽段的选择离子监测色谱图Fig.5 SIM chromatograms of marker peptideA:non-inactivated enzymatic sample;B:inactivated enzymatic sample

2.3 方法学验证

2.3.1 线性范围将特征多肽标准品稀释至质量浓度分别为0.645、1.29、3.225、19.2、6.45、12.9、21.5 μg/mL，按照“1.6”条件进样分析。以多肽标准品的质量浓度为横坐标(x,μg/mL)，对应的峰面积为纵坐标(y)绘制校正曲线。结果显示，特征多肽标准品在0.645～21.5 μg/mL范围内呈良好的线性关系，线性方程为y=6.39×109x-1.73×106，相关系数(r2)为0.999 4。

2.3.2 定量下限精密量取特征多肽标准品适量，用超纯水逐步稀释，定容，摇匀。按照“1.6”条件每个样品进样2针，记录色谱图。以信噪比为10∶1时为定量下限，测得牛Ⅰ型特征多肽标准品的定量下限为6.45×10-4μg/mL。

表2 加标回收率实验结果Table 2 Results of the sample recovery experiment

2.3.3 回收率在1 mg/mL的胶原海绵酶解液中加入3.10、2.48、1.55 μg/mL的多肽标准品，按照“1.6”条件进样分析，并计算回收率。由表2可知，3个加标水平下的平均回收率为98.2%～102%，相对标准偏差(RSD)在10%以内，表明本方法可行。

2.3.4 精密度取特征多肽标准品溶液,注入液相色谱-质谱联用仪，按照“1.6”条件连续进样6针，记录色谱图,计算峰面积的RSD为0.80%，说明仪器精密度良好，能够满足样品含量测定需求。

表3 胶原海绵均匀性检验的测量数据Table 3 Measurement data of the uniformity test of collagen standards

表4 胶原标准品的均匀性考察方差分析Table 4 Analysis of variance for collagen standard uniformity

图6 胶原海绵中牛Ⅰ型胶原含量Fig.6 Content of bovine type Ⅰ collagen in collagen spongeA：4 ℃；B：25 ℃；C：37 ℃；D：-20 ℃

表5 不同实验室的检测结果Table 5 Test results from different laboratories

2.4 牛Ⅰ型胶原含量检测

2.4.1 均匀性胶原海绵样品共210支，按顺序编号后，采用EXCEL软件生成随机数的方法，随机抽取15支样品，分别编号为S1、S2……S15。每个抽取样品按“1.6”方法重复测定2次，分析组间方差和组内方差，以评价样品的瓶内与瓶间的均匀性。采用F检验，评估样品的均匀性在单元内及单元间是否存在显著性差异。检测结果及方差分析结果见表3与表4。

经计算，统计量F=3.14，该统计量是自由度为(14，15)的F分布变量。根据自由度(14，15)，及显著水平α=0.01，可由F分布临界值表查得临界的F值为3.56。F=3.14

2.4.2 稳定性稳定性是考察在特定时间间隔和贮存条件下，物质的特性值保持在规定范围内的能力。短期稳定性实验的温度分别设为4、25、37 ℃，长期稳定性实验的温度设为-20 ℃。每个温度条件下贮存多支样品，在不同时间取出3支样品，按“1.6”方法重复测定3次。各贮存条件下的胶原含量检测结果见图6。对于稳定性的检测结果通过回归曲线方法进行判断，稳定性评估基本模型为：Y=β0+β1X。式中：β0、β1为回归系数；X为时间；Y为物质的特性值。

根据公式计算，4、25、37、-20 ℃下的斜率β1分别为-0.004、-0.007、-0.007和-0.004，截距β0分别为0.986、1.001、0.961和0.954，β1的标准偏差s(β1)分别为0.005、0.013、0.013和0.012。基于β1的标准偏差，用t检验检测其显著性，其中t0.95,1=12.7。在4、25、37、-20 ℃条件下，|β1|

2.4.3 定值利用本方法，联合3家实验室对3支胶原海绵样品进行测定，以验证方法的可行性与准确性，结果见表5。对该数据进行统计学分析，以判断是否满足定值要求并确定胶原海绵含量的标准值。首先采用t-检验法和狄克逊(Dixon)法对每一组独立检测结果进行组内可疑值检验，剔除可疑值，结果所有值均保留。然后采用科克伦(Cochran)法检验，先计算各组数据的方差，再计算其中最大方差与各组方差和之比，确保了各组数据的平均值均为等精度。随后采用格拉布斯(Grubbs)法验证了各组数据平均值均无显著性差异。最后采用夏皮洛-威尔克(Shapiro-Wilk)法检验4组数据均符合正态分布。因此，求出的总平均值：牛Ⅰ型胶原含量=(0.926±0.014) mg/mg，为准确值。

2.4.4 水分与灰分按照“1.7”方法测定胶原海绵产品的含水量为3.24%～4.05%，灰分含量为2.58%～5.32%。

3 结 论

本研究建立了一种高灵敏的牛Ⅰ型胶原定性定量的方法，从特征多肽的筛选、HPLC-MS分析和数据处理等方面进行了探讨。以牛Ⅰ型胶原为研究对象，筛选序列中的特征肽为外标，采用液相色谱-三重四极杆质谱进行定量检测。在不同的加标水平下，平均回收率为98.2%～102%，峰面积的RSD为0.80%，方法具有良好的回收率和精密度。依据国家计量技术规范《标准物质定值的通用原则及统计学原理》[19]对该牛Ⅰ型胶原海绵产品的稳定性、均匀性和定值进行测定，确定该胶原海绵产品的牛Ⅰ型胶原含量为(0.926±0.014) mg/mg，证明了方法的可行性和准确性，亦证实了该产品具有成为牛Ⅰ型胶原标准品的潜力。本文为不同类型胶原的定量分析提供了可靠准确的实验依据。