基于CRISPR/Cas9 技术快速构建PRV gE 基因缺失病毒

（内蒙古农业大学兽医学院，农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018）

伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）属于疱疹病毒科，会导致成年母猪流产、产死胎以及仔猪中枢神经系统疾病，未免疫母猪产下的仔猪感染PRV 时，死亡率可达100%[1-2]。早在1947 年，我国首次从患猫体内检测出PRV。1970 年后，PRV 在我国呈蔓延趋势，直至从匈牙利引入Bartha-K61 株疫苗后，疫情才得到有效控制[3]。2011 年以来，PRV 在我国发生变异，使Bartha-K61 疫苗不能提供足够的保护，导致伪狂犬病迅速流行，并席卷全国[4-7]，其中母猪患病率达35%以上，野毒感染猪群超过50%，对我国养猪业造成了巨大损失[8]。PRV 基因组编码许多蛋白，其中gE 蛋白是主要的毒力因子。在PRV 变异株感染的猪群中，检测发现gE基因抗体水平逐年上升。因此，gE基因缺失疫苗可以在降低病毒毒力的同时区分野毒感染和疫苗免疫[9]。我国最初引入的Bartha-K61 株就是gE基因缺失疫苗株。早在2000年，何启盖等[10]使用TK-/gG-/LacZ+突变株进行动物实验，证实PRV 基因缺失毒株的安全范围比亲本毒株广，具有很好的免疫原性。自2013 年以来，CRISPR/Cas9 技术作为强大的基因编辑技术[11]，已经在病毒基因编辑上获得了广泛应用，如：Van等[12]利用CRISPR/Cas9 技术成功编辑了HCMV和HSV-1；2018 年穆艳霞等[13]使用CRISPR/Cas9技术，利用先重组EGFP 标签反向筛选的方法成功获取了IBR-ΔgE病毒；汤艳东等[14]构建了萤光素酶标记基因、EGFP 基因双标签重组病毒，同时建立了PRV 大片段缺失平台，证实了2 个sgRNA介导的大片段基因缺失效率更高。因此，本研究基于CRISPR/Cas9 技术与实验室分离到的PRV 毒株，快速对其gE基因进行编辑，旨在为今后的PRV 基因编辑提供思路，也为后期应对PRV 变异株的基础研究及防控提供一种候选方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与细胞系 PRV-1 毒株，由内蒙古农业大学兽医学院传染病教研室分离、鉴定及保存；PK-15（猪肾细胞）、VERO（非洲绿猴肾细胞），由内蒙古农业大学传染病教研室保存。

1.1.2 主要试剂及载体 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），DMEM 培养基，opti-MEM 以及EDTA-胰酶，购自Gibco 公司；BbsI 限制性核酸内切酶，购自NEB 公司；PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 高保真酶、solution I，购自TaKaRa 公司；DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒，购自Therom公司；病毒基因组DNA/RNA 提取试剂盒，购自TIANGEN 公司；低熔点琼脂糖，购自Sigma 公司；转染试剂Lipofactamine 3 000，购自Thermo Fisher公司；大肠杆菌DH5ɑ 感受态细胞、Stbl 3 化学感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；pcDNA3.1载体、pSpCas9-2A-puro 和pSpCas9（BB）-2A-GFP 载体，由内蒙古农业大学传染病教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 PRVgE基因克隆测序 根据NCBI 上已公布的伪狂犬病毒（PRV）基因序列（登录号KU056477.1），在primer premier 5.0 软件上设计针对gE基因的上下游引物PRV-gE-F、PRV-gE-R（表1）；以本实验室提取的PRV-1 基因组为模板，采用PCR 方法扩增gE基因。PCR 反应体系：ddH2O 15 μL、GXL buffer 5 μL、dNTP 2 μL 以及PRV-gE-F、PRV-gE-R 各1 μL，PRV-1 基因组0.75 μL，GXL DNA Polymerase 酶0.25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性120 s；98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸120 s，35 个循环；68 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。PCR 产物送华大基因有限公司测序。

1.2.2 野生病毒感染力测定 将PRV-1 病毒按照10-1～10-8进行10 倍倍比稀释后，各吸取100 μL 病毒稀释液，接种于长到80%左右的PK-15 细胞上，每组8 个重复，同时设置阴性对照。逐日观察并记录结果，5 d 后按照Reed-Muench 法进行TCID50测定。计算公式为：

表1 试验所用引物及目的

将比距加在高于50%死亡稀释度的对数上，即为0.1 mL 所含病毒液的稀释度。

1.2.3 转染细胞系筛选 首先将pSpCas9（BB）-2A-GFP 载体，利用脂质体转染法（Lipofectamine®3 000），将PX459-1、PX459-2 和PX459-3 质粒分别转染PK-15 细胞与VERO 细胞，48 h 后荧光显微镜（ZEISS、HAL100）下观察，筛选转染效率较高的细胞系。

1.2.4 CRISPR/Cas9 载体构建及筛选 按照1.2.1测序得到PRVgE基因序列，通过网站http://crispr.mit.edu/设计3 对分数较高且GC 含量约50%的gE-sgRNA，并合成其互补引物对（表1）；将互补的gE-sgRNA 引物gE-sgRNA1-F/gE-sgRNA1-R、gE-sgRNA2-F/gE-sgRNA2-R 和gE-sgRNA3-F/gEsgRNA3-R 进行95 ℃ 5 min 高温变性，然后逐渐降温至16 ℃，获得3 条双链sgRNA；以BbsI 双酶切pSpCas9-2A-puro 载体，胶回收大的载体片段；将3 条双链gE-sgRNA 连入pSpCas9-2A-puro 酶切回收的载体中，使用Solution I 16 ℃过夜连接，将连接产物转化Stbl 3 感受态细胞，提取质粒，对测序结果使用snapgene 软件分析，获得CRISPR/Cas9 重组质粒PX459-1、PX459-2 和PX459-3。将构建好的PX459-1、PX459-2 和PX459-3 分别转染VERO 细胞，12 h 后接种MOI=0.1 的PRV-1，感染48 h 后使用10%中性甲醛固定2 h，之后使用0.8%结晶紫染色0.5 h，冲洗干净后观察。

1.2.5 PRV-1-ΔgE构建 利用脂质体转染法，将CRISPR/Cas9 载体PX459-1、PX459-2，按 照1:1 的比例转染入VERO 细胞培养6 h，更换含2%FBS 的细胞维持液，培养至12 h 后接种MOI=0.1的PRV-1，待细胞病变至90%左右时收毒；将病毒反复冻融3 次，按照1:1 000 稀释度稀释感染6 孔板中的PK-15 细胞，病毒吸附2 h 后，使用DMEM（含2% FBS、1%低熔点琼脂糖）覆盖，置于37 ℃、5%的CO2培养箱中培养48 h；于超净工作台中使用枪头随机挑起10 个病毒蚀斑，分别置于200 μL DMEM 中，反复冻融3 次后接种生长至90%的PK-15 细胞。重复以上步骤，噬斑克隆纯化5 代，然后将病毒接种于PK-15 细胞中扩大培养，提取病毒基因组，使用检测引物seq-PRVgE-F/R 进行PCR 扩增检测。PCR 体系与反应条件与1.2.1 中介绍相同。将测序结果使用MEGA 7 软件进行对比分析，鉴定后扩大培养，-80 ℃保存。

1.2.6 PRV-1-ΔgE遗传稳定性检测 将PRV-1-ΔgE接种至PK-15 细胞，连续传代至第20 代，并取第5、10、20 代缺失病毒DNA，使用PRV-gE-F和PRV-gE-R 进行PCR 扩增。PCR 产物送华大基因测序，并对测序结果进行比对。

2 结果与分析

2.1 PRV-1 gE 基因PCR 扩增

按照1.2.1 中PCR 体系获得的gE基因测序结果为1 740 bp，与试验预期一致（图1）。

图1 PRV gE 基因PCR 扩增结果

2.2 PRV 野毒感染力测定

野生病毒感染力测定如表2 所示。当病毒稀释至10-6时，出现CPE 的细胞孔所占百分比高于50%，为76.9%，稀释至10-7时，出现CPE 的细胞孔所占百分比低于50%，为36.4%。

将表2 所测得数据带入1.2.2 中的公式，得到的比距约为0.7，加上高于50%感染的稀释度对数（10-6），PRV-1 的TCID50为10-7.7/mL。

2.3 转染细胞系筛选

通过荧光显微镜观察，发现VERO 细胞转染效率高于PK-15 细胞（图2），因此本试验选择VERO 细胞作为转染细胞系。

2.4 CRISPR/Cas9 质粒构建与筛选

根据snapgene 软件分析结果，判定CRISPR/Cas9 质粒PX459-1、X459-2 和PX459-3 构建成功（图3）。将PX459-1、X459-2 和PX459-3 质 粒转染细胞筛选，发现sgRNA1 和sgRNA2 效率大于sgRNA3（图4），因此选择sgRNA1 和sgRNA2做后续试验。

表2 病毒TCID50 测定结果

图2 pSpCas9（BB）-2A-GFP 在PK-15 与VERO 细胞上的转染效率（50×）

2.5 PRV-1-ΔgE 构建

图3 sgRNA 构建测序结果

图4 sgRNA 筛选结果

使用seq-PRV-gE-F/R 引物进行PCR 检测，发现gE基因发生缺失（图5）；将测序结果使用MEGA 7 软件比对分析发现，PCR 产物大小为2 424 bp，与预期一致，PRV-1-ΔgE为2 132 bp，gE基因323～613 bp 位置缺失291 bp（图6）。

图5 PRV gE 基因检测引物PCR 鉴定结果

图6 PRV-1 与PRV-1-ΔgE 测序比对结果

2.6 PRV-1-ΔgE 遗传稳定性检测

将PRV-1-ΔgE连续传代至20 代，分别取5、10、20 代病毒进行测序分析，发现没有发生碱基突变现象。

3 讨论

目前，针对PRV 感染还没有系统有效的治疗方法，因此疫苗接种是控制其流行和净化的有效方法。自2011 年以来，PRV 不断发生变异，至今依然在我国部分地区广泛流行[15-16]，因此快速应对新发变异的PRV 就显得尤为重要。这些基因的缺失会导致PRV 毒力降低，且不影响病毒的感染和复制能力。据相关资料[17-18]显示，一些欧美国家通过基因缺失疫苗免疫，已经根除了PRV。PRV 基因工程疫苗研制通常选用缺失TK、gE、gI或gG等毒力基因[19-20]。

穆艳霞等[13]使用CRISPR/Cas9 技术编辑IBRV，在gE基因位置处重组EGFP 荧光标记，通过sgRNA 反向敲除EGFP 基因构建IBR-ΔgE病毒。吴凤笋[21]使用传统的同源重组结合Cre/loxp系统，先在gE、TK位置分别重组EGFP 标记基因，筛选携带荧光的PRV，后将标记基因分别切除构建了1 株PRV-ΔgE-ΔTK重组病毒。靶向基因编辑技术与传统的同源重组技术相比较，它对基因组的修饰效率可以提高103～105倍[22]。因此，本研究基于CRISPR/Cas9 技术，仅通过单独转染1 对sgRNA，接种病毒诱导细胞内非同源末端修复即获得PRV-1-ΔgE。相比较于传统的同源重组技术，CRISPR/Cas9 技术大大提高了基因编辑筛选速度与效率。首先，在CRISPR/Cas9 技术当中，筛选转染效率高的细胞系与获得高效的sgRNA至关重要。因此，本试验首先选择了PK-15 细胞与VREO 细胞作为转染细胞系，经过筛选发现VERO 细胞的转染效率远高于PK-15 细胞且可以被PRV 感染。本试验结果与汤艳东[13]、穆艳霞[14]等细胞系筛选结果一致。其次，sgRNA 的工作效率及脱靶效率直接影响基因编辑的成功率。Cho 等[23]认为成对的Cas9 内切酶共同作用于目标基因组，会使脱靶效率明显降低。在sgRNA 筛选中，本试验首先设计了3 条sgRNA，经过噬斑形成试验，筛选到2条可以高效切割病毒基因的sgRNA，最后在噬斑克隆过程中，因为没有标签，所以随机筛选了10个单独噬斑克隆。在这个过程中，要挑选相对于野生病毒噬斑稍小的噬斑克隆，突变毒株的噬斑会稍小于野生病毒[14]。同时，相比较于标签反向筛选，本试验没有插入标签，因而后期就省去了删除标签的步骤。

4 结论

综上，本试验采用CRISPR/Cas9 第3 代基因编辑技术，快速对PRV-1 进行编辑，确定了1对高效编辑PRVgE基因的sgRNA，并获得1 株PRV-1-ΔgE。本研究提供了一种高效的PRV-1 毒株编辑方法，为后续构建多基因缺失病毒提供了基础数据，也为快速应对PRV 变异及其相关变异株基础研究提供了新思路。