7-二氟亚甲基-5，4-二甲氧基染料木黄酮对氧化应激诱导的人子宫螺旋动脉内皮细胞的影响

曾丽娜

【摘要】 目的：检测7-二氟亚甲基-5，4-二甲氧基染料木黄酮（DFOG）对H2O2 氧化应激人子宫螺旋动脉内皮细胞（HUSAEC）增殖凋亡的影响。方法：体外培养HUSAEC细胞，在加入H2O2 氧化应激诱导前30 min，分别添加不同浓度DFOG（2、4、8 ?mol/L）进行预孵，MTT检测DFOG对H2O2 氧化应激诱导的HUSAEC细胞的增殖促进作用，FCM检测DFOG对H2O2 氧化应激诱导的HUSAEC细胞凋亡情况。结果：与H2O2组比较，DFOG各组明显减轻了H2O2对HUSAEC细胞增殖的抑制作用，减少H2O2氧化应激诱导HUSAEC细胞的凋亡（P<0.05），呈浓度和时间依赖性。结论：DFOG对H2O2 氧化应激HUSAEC细胞有明显的促进增殖及抑制凋亡作用，提示DFOG可能成为妊娠期高血压疾病治疗的新型药物。

【关键词】 妊娠期高血压疾病 7-二氟亚甲基-5，4-二甲氧基染料木黄酮 增殖 凋亡

Effects of 7-difluoromethy-5，4-dimethoxy Genistein on Endothelial Cells of Human Uterine Spiral Artery Induced by Oxidative Stress/ZENG Lina. //Medical Innovation of China， 2020， 17（10）： -160

[Abstract] Objective： To determine the effect of 7-difluoromethy-5，4-dimethoxy genistein （DFOG） on proliferation and apoptosis of human uterine spiral artery endothelial cells （HUSAEC） induced by H2O2 oxidative stress. Method： HUSAEC cells were cultured in vitro， 30 minutes before the induction of H2O2 oxidative stress， different concentrations of DFOG （2， 4， 8 μmol/L） were added for pre incubation. MTT was used to detect the effect of DFOG on the proliferation of HUSAEC cells induced by H2O2 oxidative stress， FCM was used to detect the effect of DFOG on the apoptosis of HUSAEC cells induced by H2O2 oxidative stress. Result： Compared with H2O2 group， DFOG group significantly reduced the inhibition of H2O2 on the proliferation of HUSAEC cells， and reduced the apoptosis of HUSAEC cells induced by H2O2 oxidative stress （P<0.05）， which was concentration and time-dependent. Conclusion： DFOG can significantly promote proliferation and inhibit apoptosis of H2O2 oxidative stress HUSAEC cells， suggesting that DFOG may be a new drug for the treatment of hypertension during pregnancy.

[Key words] Hypertension during pregnancy 7-difluoromethy-5，4-dimethoxy genistein Proliferation Apoptosis

First-authors address： The Affiliated Hospital of Putian University， Putian 351100， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.10.039

妊娠期高血壓疾病（hypertensive disorders complicating pregnancy， HDCP）是妊娠与血压升高并存的一组疾病，发生率5%～12%，是一组严重影响母婴健康的疾病，是孕产妇和围产儿病死率升高的主要原因[1]。目前HDCP病因学主要集中在子宫螺旋小动脉重铸不足、炎症免疫过度激活、血管内皮受损、遗传因素、营养缺乏、胰岛素抵抗等方面，其中子宫螺旋小动脉内皮损伤是研究HDCP的热点之一[2]。血管内皮细胞损伤是子痫前期的基本病理变化，可使扩血管物质，如一氧化氮、前列环素I2合成减少，而缩血管物质如内皮素、血栓素A2等合成增加，从而促进血管痉挛;另外血管内皮细胞损伤还可以激活血小板和凝血因子，加重子痫前期高凝状态[3]。引起子痫前期血管内皮损伤的因素很多，主要为氧化应激反应产生的炎性介质，如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子、极低密度脂蛋白等[4]。研究表明氧化应激在子痫前期的发生发展中起重要作用，H2O2是活性氧家族中重要的一员，可以体外诱导细胞凋亡;紫外线等离子射线作用于细胞后，可诱使细胞产生H2O2，进而诱导细胞发生凋亡[5]。7-二氟亚甲基-5，4-二甲氧基染料木黄酮（7-difluoromethy-5，4-dimethoxy genistein， DFOG）是一种从豆类植物提取的异黄酮化合物衍生物，具有抗氧化、抑凋亡、抗肿瘤以及类雌激素等作用[6-7]。2018年5月-2019年4月本研究拟探讨DFOG对体外培养H2O2氧化应激损伤的人子宫螺旋动脉内皮细胞（HUSAEC）的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 HUSAEC购自武汉大学中国典型培养物保藏中心;DFOG由湖南师范大学医学院药学系合成;H2O2（恒瑞医药股份有限公司）;DMEM培养基（美国Gibco公司）;胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）;MTT（美国Sigma公司）;二甲基亚砜（DMSO）购自美国Amresco公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理 HUSAEC用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、CO2体积分数为5%饱和湿度条件下培养，细胞贴壁生长后，取对数生长期的细胞用于实验。根据受试物的不同分为A、B、C、D、E组，A组为正常对照组（受试物为NS）;B组受试物H2O2（H2O2终浓度为1 mmol/L）;C、D、E各组在加入1 mmol/L H2O2前30 min，分别添加DFOG进行预孵，使DFOG终浓度分别为2、4、8 ?mol/L。即：C组受试物为DFOG 2 ?mol/L+1 mmol/L H2O2;D组受试物为DFOG 4 ?mol/L+1 mmol/L H2O2;E组受试物为DFOG 8 ?mol/L+1 mmol/L H2O2。

1.2.2 MTT测定HUSAEC细胞生长增殖抑制作用 取对数生长期的HUSAEC细胞，分别加入A、B、C、D、E组受试物，5组均予以培养24、48和72 h，改用5 mg/L MTT继续培养4 h后移去MTT混悬液，再用100 ?L DMSO溶解晶体，用酶标仪（ELX-800）570 nm波段检测吸光度值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（1-实验组吸光度值/空白对照组吸光度值）×100%，采用改良寇氏法求出IC50值[8]。以上实验重复3次。

1.2.3 PI染色流式细胞术检测HUSAEC细胞凋亡率 取对数生长期的HUSAEC细胞，分别加入A、B、C、D、E组受试物，5组均予以培养48 h，收集细胞，用冰PBS洗2遍，用4 ℃的70%的乙醇固定24 h后，碘化丙啶4 ℃避光染色，流式细胞仪检测不同受试物作用下HUSAEC细胞凋亡率[9]。以上实验重复3次。

1.3 观察指标 （1）分析DFOG对氧化应激诱导的HUSAEC细胞生长增殖活性的影响;（2）分析DFOG对氧化应激诱导的HUSAEC细胞凋亡的影响。

1.4 统计学处理 采用SPSS 12.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间均数比较，采用单因素方差（One-Way ANOVA）分析，多组间均数组间两两比较采用SNK法（q检验）进行单因素方差分析;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DFOG对氧化应激诱导的HUSAEC细胞生长增殖活性的影响 B组HUSAEC细胞24、48、

72 h细胞增殖活性分别为（87.51±2.93）%、（70.24±3.79）%和（41.39±5.26）%，表明H2O2可以抑制细胞的生长增殖。C组HUSAEC细胞24、48、72 h细胞增殖活性分别为（94.30±2.04）%、（81.09±3.25）%和（75.57±3.52）%;D组HUSAEC细胞24、48、72 h细胞增殖活性分别为（96.21±1.87）%、（84.73±2.98）%和（80.94±3.39）%;E组HUSAEC细胞24、48、72 h细胞增殖活性分别为（97.12±1.63）%、（88.31±2.87）%和（84.53±3.12）%。随着DFOG浓度的增加以及培养时间的延长，逐渐改善H2O2氧化应激诱导HUSAEC细胞的增殖抑制，其中E组改善效果最明显。24、48、72 h，C、D、E组的细胞增殖活性均高于B组，差异均有统计学意义（P<0.05），见图1。

图1 DFOG对氧化应激诱导的HUSAEC细胞生长增殖活性的影响

2.2 DFOG对氧化应激诱导的HUSAEC细胞凋亡的影响 48 h后，A、B、C、D、E组细胞凋亡率分別为（4.96±2.17）%、（51.64±3.50）%、（42.33±5.16）%、（31.68±4.90）%、（20.44±3.19）%，C、D、E组的细胞凋亡率均低于B组，差异均有统计学意义（P<0.05）;C、D、E各组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05），提示作用呈浓度依赖性。见图2。

3 讨论

黄酮类化合物广泛存在于各种植物中，具有明显的抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用，通过与靶蛋白的结合，对细胞凋亡进行调节，是其机制之一，有研究表明，黄酮类化合物可以调节动静脉内皮细胞凋亡，促进细胞增殖，预防内皮细胞损伤[10-11]。染料木黄酮又名金雀异黄素、染料木苷元，化学名为4，5，7-三羟基异黄酮，分子式为C15H10O5（相对分子量为270.2 g/mol），是大豆异黄酮的主要成分。以染色木黄酮为先导化合物，在C-7位引入二氟亚甲基、C-5，4位引入甲氧基，定向化学改造得到的DFOG具有更强的拮抗血管内皮细胞氧化应激损伤的活性[12]。因此，本实验通过体外培养H2O2氧化应激损伤的HUSAEC细胞，观察DFOG对HUSAEC细胞的增殖抑制活性及细胞凋亡效用，并进一步探讨其可能的分子生物学机制。

Marinova等[13]研究表明DFOG体外通过调节神经蛋白而对神经母细胞瘤U0126细胞有增殖抑制的作用，而对正常神经细胞无毒性或毒性很小。Hernández等[14]研究表明DFOG通过调节5-HI的表达，增强脑细胞抗氧化作用，提高阿尔茨海默病的临床效果。徐丛荣等[15]采用MTT比色法观察到染料木黄酮能明显抑制体外培养的宫颈Hela细胞的增殖，对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用具有剂量依赖性，随着染料木黄酮药物浓度的增大，其对Hela细胞的增殖抑制作用也逐渐增强。2019年姜雪梅等[16]研究发现染料木黄酮通过抑制ERK及JNK的活化从而抑制人非小细胞肺癌PC14细胞的增殖。目前DFOG对HUSAEC氧化应激损伤作用方面的文献报道较少。胎盘滋养细胞是胎盘的主要细胞类型之一，滋养细胞的功能障碍可以导致活性氮和活性氧的产生，进而激活母体血管内皮细胞，引起子痫前期相关的多系统功能障碍[17]。子痫前期胎盘滋养层细胞活性下降，其中子痫前期胎盘滋养层谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽氧化还原比（GRR）和总抗氧化能力（TAC）水平明显降低，染料木黄酮孵育子痫前期胎盘滋养层细胞后，GPx、GRR和TAC水平明显升高，提示染料木黄酮可以改善子痫前期胎盘滋养层细胞的氧化应激水平[17]。本研究通过体外培养H2O2氧化应激诱导的HUSAEC细胞，验证DFOG可以改善氧化应激诱导损伤的HUSAEC细胞生长，降低细胞凋亡率。文献[18-19]报道DFOG对氧化诱导的血管内皮细胞与单核细胞黏附及黏附分子E选择素、细胞间黏附分子1的释放有明显抑制作用，其作用机制可能与下调核因子κB和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2的表达有关;DFOG对H2O2诱导血管内皮细胞凋亡有明显的抑制作用，其作用机制可能是通过降低活性氧的生成，下调Caspase-3的表达，从而拮抗H2O2诱导的血管内皮细胞凋亡。

综上所述，DFOG对H2O2诱导氧化应激损伤的HUSAEC细胞有明显的促进增殖及抑制凋亡作用，本课题组将进一步研究其可能的分子生物学机制，为HDCP的治疗提供理论依据和实验数据。

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（收稿日期：2019-08-28） （本文编辑：姬思雨）