尿素脱胶对丝素蛋白气凝胶力学性能的影响

王宗乾， 杨海伟， 周 剑， 李长龙

(1. 安徽工程大学 纺织服装学院， 安徽 芜湖 241000； 2. 中山大学 材料科学与工程学院， 广东 广州 510275)

丝素蛋白(SF)是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白[1]，在蚕丝中质量分数占70%～80%，具有良好的生物相容性、生物降解性以及优异的力学性能[2-3]。同时SF易于加工和修饰，通过多样化的制备方法，可获得多种形态的SF材料，如水凝胶[4]、多孔支架[5]、薄膜[6]、纳米纤维[7]、微球[8]、微针[9]等，在组织工程、药物缓释系统以及人造皮肤等领域具有广阔的应用前景。近年来，SF在气凝胶领域中得到了广泛的应用。SF气凝胶是独立于无机气凝胶(如SiO2气凝胶等)和有机聚合物气凝胶(如间苯二酚甲醛和三聚氰胺甲醛气凝胶等)材料之外的生物聚合物气凝胶材料，在传统气凝胶材料特性(如超低密度、高比表面积、超高孔隙率、极低的传热系数、低光折射率、低介电常数等)[10-12]基础上，增加了生物降解和生物相容性的优势[13]，使得SF气凝胶在生物医用材料等领域中具有极大的发展潜力[14-15]。

将蚕丝蛋白用于气凝胶材料的开发，脱胶是极其重要的一步。目前，在SF气凝胶制备过程中普遍采用碳酸钠溶液对蚕丝进行脱胶处理[16-18]，但煮沸的碳酸钠溶液会使SF肽链发生严重的断裂[19]，使SF的相对分子质量降低，导致SF气凝胶的力学性能较差，因此，为改善SF气凝胶的力学性能，通过向SF溶液中加入交联剂(如甲基三甲氧基硅烷[20-21]、丁二醇二缩水甘油醚[22]等)制备得到力学性能优异的SF混合气凝胶。然而，这些合成交联剂的使用可能损害SF的生物性优势。相比碳酸钠脱胶方法，非碱体系的尿素脱胶对SF的损伤较小，经溶解制备的再生SF的黏度和相对分子质量较大，有利于改善再生SF材料的结构和性能[23-24]。Wang等[19]对比分析了尿素、碳酸钠和强碱性电解水等脱胶方法对SF膜结构和性能的影响，研究结果也表明尿素脱胶对SF的损伤最小，且显著提高了SF膜的力学性能、热稳定性和结晶度。

综上可知，采用非碱体系的尿素脱胶可减少对SF的损伤，提高其相对分子质量，改善SF材料的结构和性能。与目前已报道的加入交联剂改善SF气凝胶力学性能的方法相比，尿素脱胶不仅可改善SF气凝胶的力学性能，还能保证其生物性免受损害。目前关于尿素脱胶对SF气凝胶力学性能影响的报道较少。为此，本文以尿素脱胶蚕丝为原料制备了SF气凝胶，并与碳酸钠脱胶蚕丝制备的气凝胶进行对比分析，阐述了尿素脱胶对SF气凝胶力学性能的影响规律与作用机制，以期为高强度SF气凝胶的制备提供实验与理论基础。

1 实验部分

1.1 实验材料

蚕生丝，安徽青阳县三方丝绸有限公司；尿素、无水碳酸钠、无水氯化钙、无水乙醇，上海阿拉丁试剂有限公司；苦味酸，台山众城化工有限公司；胭脂红，阿达玛斯试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 SF溶液的制备

根据文献[23]中尿素和碳酸钠脱胶工艺分别对蚕生丝进行脱胶，后经苦味酸胭脂红染色法[25]判定丝胶已被完全除去，脱胶蚕丝可视为丝素蛋白集合体。

分别将尿素、碳酸钠脱胶后的蚕丝加入氯化钙、乙醇和水(三者的量比为1∶2∶8)的三元溶剂中，浴比为1∶20，在80 ℃下振荡溶解2 h。然后将溶解后的丝素蛋白液分别装入截留分子质量为8～14 ku的透析袋中，在超纯水中持续透析3 d，每4 ～ 6 h更换一次水以除去氯化钙和乙醇，经质量测试法测试透析后丝素蛋白液的质量分数为2.0%。

1.3 SF气凝胶的制备

将透析后SF溶液的质量分数稀释至1.4%，然后分别装入外径为17 mm，内径为14 mm的塑料离心管中，在-20 ℃下冷冻15 h，随后放入LGJ-10型真空冷冻干燥机(北京松原华兴科技发展有限公司)中在-50 ℃下干燥48 h，制备得到SF气凝胶。本文实验中，分别将尿素和碳酸钠脱胶蚕丝制备的气凝胶记为SF-U和SF-S气凝胶。

1.4 测试方法

1.4.1 密度测试

将圆柱形SF气凝胶切成长度约为20 mm， 使用数显卡尺和分析天平测量气凝胶的尺寸(长度和直径)和质量，以计算SF气凝胶的密度[26]。

1.4.2 力学性能测试

采用H10 K-S型万能材料试验机(美国锡莱亚太拉斯有限公司)对SF气凝胶的力学性能进行测试。所有测试的SF气凝胶均为圆柱体，其直径和高度分别约为10和20 mm，压缩速率为1 mm/min，根据得到的应力-应变曲线的斜率计算压缩模量。各样品测试5次，取平均值。

1.4.3 微观形貌观察

在SF气凝胶样品上镀金处理后，使用S-4800型扫描电子显微镜(SEM，日本日立公司)在5 kV的加速电压下观察SF气凝胶的微观形貌。

1.4.4 化学结构测试

采用Spectrum Two 型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR， 美国铂金埃尔默公司)对SF气凝胶的化学结构进行测试。测试条件为：分辨率4 cm-1，扫描次数32，波数范围4 000 ～ 500 cm-1。

为定量分析SF气凝胶中二级结构的变化，选取酰胺Ⅰ带对应的 1 700～1 600 cm-1波数范围的红外光谱，并用Origin 9.0软件通过Savitzky-Golay法，采用15点三次函数对红外光谱曲线进行平滑处理并求其二阶导数光谱，通过二阶导数光谱在1 700～1 600 cm-1波数范围内寻找各种类型二级结构的峰位，并结合Origin中高斯(Gaussian)分峰拟合方法得到各二级结构子峰的分布和强度，根据各子峰峰面积即可统计SF气凝胶中二级结构的类型和相对含量[27]。

1.4.5 结晶结构测试

采用D8系列X射线衍射仪(XRD，德国布鲁克公司)对SF气凝胶的结晶结构进行测试，测试条件为：Cukα靶(波长为0.154 nm)，电压40 kV，电流 30 mA，衍射角度扫描范围5° ～ 40°，扫描步长0.02°，扫描速度2(°)/min。此外，基于SF气凝胶的XRD谱图，通过Herman方法[28]计算SF气凝胶的结晶度。

2 结果与讨论

2.1 SF气凝胶的力学性能分析

本文通过计算得到尿素脱胶蚕丝和碳酸钠脱胶蚕丝制备的SF-U和SF-S气凝胶的密度分别为(13.43±0.77)和(12.76±1.01) mg/cm3，其对应的力学性能测试结果如图1所示。可知，2种气凝胶的应力-应变曲线均呈现3个阶段，分别为低应变下的线性弹性区间，中等应变下的非线性塑性变形平台以及高应变下应力急剧增加区。同时，依据应力-应变曲线计算压缩强度与压缩模量发现，相较于SF-S气凝胶，SF-U气凝胶的抗压缩强度与抗压缩模量均有显著提升，当压缩形变为70% 时，SF-U 气凝胶的压缩强度与压缩模量可分别达到(32.36±2.35)和(119.31±8.93) kPa，表明采用非碱体系的尿素脱胶有助于提升SF气凝胶的力学性能。进一步通过简单的压缩测试可以发现， SF-U气凝胶可支撑2枚一元硬币重量且不被压缩变形，而SF-S气凝胶经相同规格的1枚硬币压缩时，已出现明显的压缩变形，再次表明SF-U气凝胶的抗压缩性能明显优于SF-S气凝胶。

图1 2种SF气凝胶的压缩应力-应变曲线Fig.1 Compressive stress-strain curve of two different SF aerogels

2.2 SF气凝胶的微观形貌分析

图2示出SF-U和SF-S气凝胶材料的微观扫描电镜照片。可以看出，二者具有显著差异：SF-U气凝胶具有稳定的立体骨架结构，整个气凝胶结构中均匀分布着尺寸在几十到几百微米区间的空洞；SF-S气凝胶结构混杂，骨架结构不完整，且以纤细化的薄片层堆砌结构为主，孔洞尺寸与分布也不均一，推测与冷冻干燥过程中气凝胶发生的变形坍塌有关[29]。综上可知，稳定的立体骨架结构是SF-U气凝胶具有较高力学性能的重要缘由。

图2 SF-U和SF-S气凝胶的扫描电镜照片(×100)Fig.2 SEM images of SF-U (a) and SF-S (b) aerogel (×100)

2.3 SF气凝胶的二级结构分析

采用FT-IR对SF气凝胶的二级结构进行分析，结果如图3所示。可知，红外谱图中1 700 ～ 1 600、 1 600 ～ 1 500 cm-1波段分别对应于丝素蛋白骨架的酰胺I带、酰胺II带特征吸收峰。进一步地，2种SF气凝胶在1 516和1 530 cm-1处都出现了特征吸收峰，分别对应酰胺II中的 β-折叠和无规则卷曲结构[18]。在酰胺I带中，SF-S气凝胶在1 644 cm-1处的特征峰对应为无规则卷曲结构，而在SF-U气凝胶中则转移至1 638 cm-1处，这是由于SF中的无规则卷曲构象向 β-折叠构象转变所致[30-31]。

图3 SF-U和SF-S气凝胶的FT-IR光谱图Fig.3 FT-IR spectra of SF-U and SF-S aerogels

文献[32-33]表明蛋白质的二级结构可用酰胺I带表征，因此，为定量地分析SF气凝胶中二级结构的变化，对酰胺I带的红外光谱图进行高斯分峰拟合，结果如图4所示，并依据各子峰的峰面积统计各类二级结构的相对含量如表1所示。其中，1 655 ～ 1 642和1 690 ～ 1 670 cm-1处代表无规卷曲构象(I)，1662～ 1 656 cm-1处代表 α-螺旋构象(II)，1 640 ～ 1 615 cm-1处代表 β-折叠构象(III)[34-35]。

图4 SF-U和SF-S气凝胶的高斯分峰拟合曲线Fig.4 Gaussian peak fitting of SF-U (a) and SF-S (b) aerogel

表1 SF气凝胶二级结构拟合结果Tab.1 Fitting results of secondary structures in SF aerogel

由表1可知：SF-U、SF-S气凝胶中各类二级结构的含量表现出较大差异；相较于传统的SF-S气凝胶，SF-U气凝胶的无规则卷曲结构含量明显降低，α-螺旋与 β-折叠二级结构相对含量提高，其中β-折叠结构相对含量超过50%，已成为相对含量占据绝对优势的二级结构。

文献[36]还表明，β-折叠结构及其含量是决定SF材料力学性能的关键因素，SF-U气凝胶中 β-折叠结构的含量高于SF-S气凝胶，使得其力学性能得到改善。在前期研究中已发现，尿素脱胶对SF的损伤较小[23-24]，经溶解制备的SF相对分子质量较大，溶液中SF分子在冷冻过程中易发生聚集，进而引起其构象从无规则卷曲转变为 β-折叠构象[37]，导致 SF-U 气凝胶中 β-折叠构象的含量较高；而碳酸钠脱胶对SF损伤较大，经溶解制备的SF相对分子质量较小，SF较低的相对分子质量影响了其构象由无规则卷曲向 β-折叠的转变。

2.4 SF气凝胶的结晶结构分析

图5示出SF-U、SF-S气凝胶的XRD谱图。可以看出，SF-U和SF-S气凝胶均在 2θ为9.1°和22.5°处出现了特征衍射峰，分别对应silk II 和silk I 构象[38-39]。此外，SF-U气凝胶在2θ为20.3°附近出现了比较尖锐的特征衍射峰，为典型的silk II 构象衍射信号[38]，采用Herman法计算SF-U气凝胶的结晶度为49.33%。SF-S气凝胶在2θ为19.7°附近出现了较宽的衍射峰，该峰位与silk I 构象相对应[40]，经计算其结晶度为38.54%。这主要是因为尿素降低了脱胶对SF肽链的损伤，溶解制备的SF相对分子质量较高，在水溶液中易于聚集，经冷冻和冷冻干燥后形成了规整的silk II 结构(即 β-折叠)可提高SF气凝胶的结晶度，这与SF气凝胶二极结构的FT-IR分析结果相一致。综上，SF-U 气凝胶具有更为显著的silk II 构象特征，且结晶度较高，使得分子具有高水平的取向，阻碍了分子链的滑动，从而改善了SF-U气凝胶的压缩性能。

图5 SF-U和SF-S气凝胶的XRD谱图Fig.5 XRD spectra of SF-U and SF-S aerogels

3 结 论

1) 基于尿素脱胶蚕丝，丝素蛋白(SF)的溶解、透析、稀释以及冷冻干燥等工艺制备得到密度为(13.43±0.77) mg/cm3的SF气凝胶。

2) 非碱性体系的尿素脱胶减少了脱胶对SF的损伤，溶解制备的SF相对分子质量较大，在溶液中易于聚集，经冷冻干燥后形成了稳定的立体骨架结构，且SF气凝胶二级结构中的无规则卷曲结构向 β-折叠结构转变，具有典型的silk II构象，结晶度提高，进而改善了SF气凝胶的力学性能。

3) 压缩形变为70% 时，尿素脱胶制备的SF气凝胶的压缩强度和压缩模量分别为(32.36±2.35)和(119.31 ± 8.93) kPa，远高于碳酸钠脱胶制备的SF气凝胶。