一色齿毛菌对直接大红4BS染料的脱色

徐红云， 于 存， 苏 帮

(1. 贵州民族大学 生态环境工程学院， 贵州 贵阳 550025； 2. 贵州大学 林学院， 贵州 贵阳 550025)

染色废水具有色度大、成分复杂、有机物含量高等特点，如果不经处理就排放到环境中会造成污染[1-3]。目前纺织染色废水处理方法包括物理、化学和生物法等[4-5]，其中以物理和化学法应用较多。常规的染色废水处理方法多存在处理成本高、操作难度大、易产生二次污染等特点。其中，利用生物进行染料废水处理避免了二次污染，且具有环境友好、操作简单等优点，使得利用生物进行染料废水治理受到广泛关注和研究[6]。

目前，可用于治理染色废水的生物类群包括真菌、细菌、放线菌和藻类等。其中以真菌和细菌对染料脱色的相关研究最为广泛。目前为止，已发现脱色真菌的种类达几十种，涉及米根酶(Rhizopusoryzae)、烟曲霉(Aspergillusfunigatus)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、白腐真菌等，其中以白腐真菌研究最为广泛[7]。自 1980年发现黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)能够通过产生漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和菌丝吸附作用对染料脱色以来[8]，关于可对染料脱色的白腐真菌种类的筛选、脱色条件的优化、脱色机制等方面的研究有很多[9-11]。以往研究显示，白腐真菌对染料的脱色受多种因素的影响，包括白腐真菌分泌降解酶的能力，染料的结构，脱色过程中所处环境的营养元素种类及浓度，金属离子、酸碱度和温度等[12-14]，因此，筛选脱色较强的白腐真菌菌株，并对其脱色条件进行优化对废水染料的生物脱色具有重要意义。

一色齿毛菌(Cerrenaunicolor)是一种广泛分布于世界范围内的白腐真菌。已有研究显示，一色齿毛菌对多种染料具有较强的脱色能力[10,12]。本文利用一色齿毛菌对5种直接染料进行脱色效果的检测；同时对一色齿毛菌脱色直接大红4BS的脱色条件进行优化，以期为白腐真菌在直接染料废水治理方面的应用研究提供参考。

1 试验部分

1.1 试验材料与仪器

菌株：一色齿毛菌，自制，菌丝体保存于4 ℃冰箱中。

染料：直接深蓝L-3RB、直接嫩黄3GN、直接金黄2GL、直接耐晒黑G、直接大红4BS，生工生物工程(上海)股份有限公司。

试剂：果糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨、琼脂粉、硝酸铵(NH4NO3)、硝酸钠(NaNO3)、硫酸铵((NH4)2SO4)、尿素、盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)、硫酸镁(MgSO4·7H2O)、氯化钙(CaCl2)、氯化铁(FeCl3·6H2O)、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、硫酸锰(MnSO4)、硫酸铜(CuSO4·7H2O)等，均为分析纯，贵州格瑞恩生物科技有限公司。

仪器：722型紫外-可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；DH124D型恒温培养箱(天津泰斯特仪器有限公司)；Q200型恒温振荡培养箱(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；PHS-3C型酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 一色齿毛菌对直接染料的脱色试验

首先配制马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:去皮马铃薯质量浓度为 20 g/L，葡萄糖质量浓度为 20 g/L，琼脂质量浓度为15 g/L，蒸馏水定容至1 L。在配制过程中，分别向培养基中加入染料质量浓度为50 mg/L的直接耐晒黑G、直接深蓝L-3RB、直接大红4BS、直接嫩黄3GN、直接金黄2GL作为染料固体培养基。培养基经121 ℃高温高压灭菌后，倒入90 mm培养皿中，分别在不同染料的培养基中接入新活化的一色齿毛菌菌饼(直径为1 cm)，于28 ℃培养箱中暗培养。以不接入菌饼的培养基作为对照，培养20 d后比较培养基颜色变化，检测一色齿毛菌对直接染料的脱色能力。

1.2.2 培养条件对一色齿毛菌脱色效果影响

以直接大红4BS为脱色目标物，首先配制液体染料发酵培养基，其中马铃薯质量浓度为20 g/L，改变培养基碳源种类(分别以20 g/L的果糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉作为碳源，以不添加碳源的培养基作为对照)、氮源种类(分别以1 g/L的硝酸铵、硝酸钠、硫酸铵、尿素、蛋白胨作为氮源制作培养基，以不添加氮源的培养基作为对照)、pH值(分别调整培养基的pH值为3、5、7、9、11，以不调整pH值的培养基作为对照)、金属离子(分别添加浓度为1 mmol/L的硫酸镁、氯化钙、氯化铁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜制作培养基，以不添加金属离子的培养基作为对照)、染料质量浓度(分别调整培养基中染料最终质量浓度为10、50、100、250 mg/L)，并用蒸馏水定容至1 L。取3片直径为1 cm活化后的菌丝接种至不同培养基中，于28 ℃培养箱中暗培养13 d后，利用紫外-可见分光光度计测定发酵液吸光度，考察不同培养条件对一色齿毛菌脱色效果的影响。

1.2.3 脱色正交试验优化

以直接大红4BS为脱色目标物，按照表1正交试验配方配制液体染料发酵培养基，并接入一色齿毛菌菌饼，于28 ℃培养13 d后，测定发酵液吸光度并计算脱色率。

表1 脱色正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 染料吸光度测定和染料脱色率的计算

在100 mL三角烧瓶中装入50 mL不同处理条件下的液体染料发酵培养基，经121 ℃高温高压灭菌后，分别向每个三角烧瓶中接入菌饼3片(直径为 1 cm)后，经28 ℃培养箱暗培养13 d，在培养的第1、4、7、10、13天吸取2 mL发酵液，经 10 000 r/min 离心5 min后，吸取1 mL上清液，在直接大红4BS的最大吸收波长λmax为507 nm处，利用紫外-可见分光光度计测定其吸光度。脱色率计算公式为

R=(A1-A0)/A0×100%

式中：R为脱色率，%；A0、A1分别为脱色前后染料发酵液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 一色齿毛菌对不同染料的脱色效果

图1示出一色齿毛菌对直接深蓝L-3RB、直接嫩黄3GN、直接金黄2GL、直接耐晒黑G、直接大红4BS这5种直接染料在固体条件下的脱色结果。可以看出，一色齿毛菌可不同程度地对5种直接染料进行脱色，其中直接大红4BS脱色前后的颜色变化最为明显。分析一色齿毛菌对不同直接染料脱色效果不同的主要原因是与染料的成分和结构的差异有关[15]。在接下来的研究中选择更易被一色齿毛菌脱色的直接大红4BS作为后续脱色效果的试验对象。

图1 一色齿毛菌对5种直接染料的脱色效果Fig.1 Decolorization of 5 kinds of direct dyes by Cerrena unicolor

图2 不同碳源条件下一色齿毛菌对直接 大红4BS的脱色率Fig.2 Decolorization of Direct Scarlet 4BS under different carbon sources by Cerrena unicolor

2.2 碳源种类对脱色效果的影响

不同碳源种类对一色齿毛菌脱色直接大红4BS的脱色率测试结果如图2所示。可以看出，与对照样相比，添加碳源均可促进一色齿毛菌对直接大红4BS的脱色。其中以葡萄糖为碳源的试样脱色效果最佳，蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、果糖等其他碳源对一色齿毛菌脱色的促进效果则依次减弱，表明添加碳源对一色齿毛菌的脱色具有促进作用，且不同碳源对脱色促进作用不同。其原因可能是碳源的加入促进了白腐菌降解酶的分泌，或碳源的加入对菌丝的促进作用进而增加了菌丝对染料的吸附[8,10]。

2.3 氮源种类对脱色效果的影响

不同氮源种类对一色齿毛菌脱色直接大红4BS脱色测试结果如图3所示。可以看出，与不添加氮源的对照组试样相比，所添加的几种氮源均有利于一色齿毛菌对直接大红4BS的脱色。其中蛋白胨、尿素、硝酸铵、硝酸钠、硫酸铵作为氮源，对一色齿毛菌脱色的促进作用依次增强，尤其是硫酸铵更有利于一色齿毛菌的脱色。原因是添加适宜的氮源可促进菌丝的生长和白腐菌降解酶活性的提高[10]，进而加强一色齿毛菌对直接大红4BS的脱色。

图3 不同氮源条件下一色齿毛菌对直 接大红4BS的脱色率Fig.3 Decolorization of Direct Scarlet 4BS under different nitrogen sources by Cerrena unicolor

2.4 金属离子种类对脱色效果的影响

金属离子对一色齿毛菌脱色直接大红4BS脱色率测试结果如图4所示。可以看出：与不添加金属离子相比，添加硫酸镁、硫酸铜、氯化铁、硫酸锌、氯化钙均可促进一色齿毛菌对直接大红4BS的脱色，其中以添加硫酸镁对一色齿毛菌脱色的促进效果最明显；而添加硫酸锰则不利于一色齿毛菌对直接大红4BS的脱色。原因是金属离子对白腐菌生长和产生降解酶具有一定影响[10]，添加适宜的金属离子可促进白腐菌降解酶的分泌，进而增强脱色效果。

图4 不同金属离子条件下一色齿毛菌对 直接大红4BS的脱色率Fig.4 Decolorization of Direct Scarlet 4BS under different metal ions by Cerrena unicolor

2.5 pH值对脱色效果的影响

不同pH值条件下，一色齿毛菌对直接大红4BS的脱色结果如图5所示。

图5 不同pH值条件下一色齿毛菌对 直接大红4BS的脱色率Fig.5 Decolorization of Direct Scarlet 4BS under different pH values by Cerrena unicolor

由图5可以看出：pH值为7时更利于一色齿毛菌对直接大红4BS的脱色；而过酸和过碱条件均不利于一色齿毛菌对直接大红4BS的脱色。当pH值由7逐渐降低时，染料脱色率随之降低；当pH值为3时，脱色率维持在极低的水平；当pH值由7逐渐增加时，一色齿毛菌对直接大红4BS的脱色亦逐渐降低；当pH值为11时，脱色率亦维持在较低的水平。这是因为白腐菌分泌降解酶受pH值条件的影响，过酸或过碱条件均不利于白腐菌降解酶的产生。本文研究中，适宜的脱色pH值范围与一色齿毛菌分泌降解酶的适宜pH值规律相近[10]。

2.6 染料质量浓度对脱色效果的影响

白腐菌对染料的脱色主要通过其分泌降解酶的降解作用和菌丝吸附作用共同完成。其中，白腐菌降解酶在染料脱色过程中，当染料质量浓度较高时，过高质量浓度的染料形成相对更多的染料大分子空间结构，进而会阻碍染料与降解酶分子活性中心的结合。而菌丝在吸附染料达到饱和后，就不能继续吸附更多的染料。此外，人工合成染料通常具有毒性，较高浓度的染料产生更高的毒性，会对白腐菌菌丝生长产生一定影响[12]，因此，研究白腐菌对特定染料的降解范围可为白腐菌降解染料的实际应用提供理论依据。染料质量浓度对一色齿毛菌脱色直接大红4BS的影响结果如图6所示。可以看出：当染料质量浓度在较低水平(10 mg/L)时，脱色率维持在较高的水平；随染料质量浓度继续增加，脱色率会逐渐下降；当染料质量浓度为250 mg/L时，脱色率下降明显，维持在较低的水平；因此，利用一色齿毛菌降解直接大红4BS的质量浓度范围不宜过高，以免降低脱色效率。

图6 不同染料质量浓度下一色齿毛菌 对直接大红4BS的脱色率Fig.6 Decolorization of Direct Scarlet 4BS under different dye concentration conditions by Cerrena unicolor

2.7 一色齿毛菌的脱色条件优化分析

一色齿毛菌对直接大红4BS脱色的正交试验优化结果见表2。可知，9个试验组合条件下染料脱色率范围在74.37%～89.12%。通过比较正交试验各因素不同水平均脱色率均值大小可知，最优条件为A2、B2、C3、D1，即：葡萄糖质量浓度20 g/L、硫酸铵质量浓度1 g/L、硫酸镁浓度1.5 mmol/L、50 mL染料发酵液中接菌量2片(直径为1 cm)。为分析 4个因素对一色齿毛菌脱色影响的程度大小，进行了极差R分析，由表2中R值结果可知，不同因素对脱色影响程度的顺序为：接菌量>硫酸镁浓度>硫酸铵质量浓度>葡萄糖质量浓度。

表2 一色齿毛菌脱色直接大红4BS正交试验优化结果Tab.2 Optimization of decolorizing condition of Direct Scarlet 4BS by Cerrena unicolor by orthogonal test

2.8 正交试验优化结果验证

在2.7节优化条件及1.1节液体染料发酵培养基条件下(优化前)进行染料的脱色，结果如图7 所示。可以看出：优化条件下的染料脱色率明显高于优化前的脱色率；当脱色至13 d时，一色齿毛菌对直接大红4BS的脱色率达到92.00%，高于正交试验优化组合中最高脱色率(89.12%)，进而验证了正交试验预测结果的正确性。与优化前第13天脱色率相比，优化后第13 天的脱色率提高了50.82%。

图7 脱色条件优化前后一色齿毛菌对 直接大红4BS的脱色率Fig.7 Decolorization rate of Direct Scarlet 4BS by Cerrena unicolor before and after decolorization

3 结 论

1)一色齿毛菌对直接深蓝L-3RB、直接嫩黄3GN、直接金黄2GL、直接耐晒黑G、直接大红4BS这 5种直接染料均有一定的脱色效果，其中对直接大红4BS的脱色效果更为明显。

2)一色齿毛菌对直接大红4BS单因素条件下的脱色结果显示，以葡萄糖作为碳源，硫酸铵作为氮源，硫酸镁作为金属离子，pH值为中性的处理条件更利于一色齿毛菌对直接大红4BS的脱色。染料质量浓度对脱色效果的影响试验结果显示，随染料质量浓度的升高，染料脱色率逐渐下降，一色齿毛菌脱色直接大红4BS的质量浓度不宜超过250 mg/L。

3)一色齿毛菌对直接大红4BS脱色的优化条件为：葡萄糖质量浓度20 g/L，硫酸铵质量浓度 1.0 g/L，硫酸镁浓度1.5 mmol/L，50 mL染料发酵液中接菌量2片(直径为1 cm)。在该条件下，脱色13 d时脱色率与优化前相比提高了50.82%。