基于激光散斑对比成像技术的化痰通络法对脑梗死大鼠脑血流的影响❋

徐家淳，孙伟明，覃启京，王 凯，程汝珍，李 强，纪 靖，周 震Δ

(1.天津中医药大学第二附属医院，天津 300150； 2. 天津中医药大学，天津 300193； 3. 广西国际壮医医院，南宁 530201)

脑血流下降是脑梗死发生后最直接的表现，也是引起脑组织损害的根本原因[1-2]。脑梗死后缺血中心区缺乏血流供应，导致神经元不可逆性坏死；半暗带血流灌注较低，但处于动态变化中，若能及时恢复血流供应，该区神经元可继续存活并发挥功能，神经功能可恢复。因此，及时恢复血流供应，拯救半暗带是治疗脑梗死的关键。本课题组一直致力于化痰通络法治疗脑梗死的临床和实验研究，临床中发现该法可有效改善脑梗死患者神经功能，提高日常生活能力[3-4]。实验研究亦发现，该法能减少溶栓后再梗死，预防出血转化，保护神经元[5-6]。本研究中课题组首次将激光散斑对比成像技术应用于观察化痰通络法改善急性脑梗死大鼠脑血流的动态变化，为揭示化痰通络法治疗脑梗死的作用机制提供部分实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级SD雄性大鼠27只，体质量240～260 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证号SCXK(京)2012-0001)；大鼠均饲养于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心12 h光照-黑暗交替，室温23～25 ℃，相对湿度50%～60%。采用随机数字表法将27只大鼠随机分为假手术1 d、3 d、7 d组，模型1 d、3 d、7 d组，中药1 d、3 d、7 d组，每组3只。造模前适应性喂养1周，食水自由。

1.2 主要试剂与仪器

生理盐水(石家庄四药有限公司)；水合氯醛(天津市致远化学试剂有限公司)。

激光散斑成像系统(南开大学电子信息与光学工程学院)；T60电磨机(永康市奇创工贸有限公司)；脑立体定位仪(瑞沃德)。

1.3 化痰通络法复方

化痰通络法复方组成：天麻10 g，半夏10 g，丹参30 g，胆南星5 g，川芎10 g，地龙10 g，酒大黄5 g。将上述药物400 g(5付)加水浓缩至500 mL，生药浓度为0.8 g/mL，由天津中医药大学第二附属医院制剂中心制备，4 ℃冰箱保存备用。

2 方法

2.1 造模

2.1.1 造模时点 按照大鼠分组制备假手术组1 d、3 d、7 d大鼠，模型组1 d、3 d、7 d MCAO大鼠，中药组1 d、3 d、7 d MCAO大鼠，每组每个时间点3只大鼠。

2.1.2 造模方法 本实验参照Longa线栓法[7]将中药组及模型组大鼠制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型：麻醉大鼠后仰卧位固定，备皮消毒颈部皮肤暴露左侧颈总动脉(CCA)，沿CCA向上分离左侧颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，在CCA远心端和近心端及ECA靠近分叉处挂棉线备用，微动脉夹暂时夹闭ICA，近心端结扎CCA、ECA，距CCA分叉5 mm处剪一小口，插入栓线至ICA微动脉夹处，松开动脉夹，棉线拴牢栓线，进栓距分叉处18 mm左右遇到阻力时停止进栓，系牢CCA远心端的细线，常规清理并缝合手术创口，消毒手术切口皮肤。假手术大鼠仅暴露并分离颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉不进栓，所有实验大鼠术前禁食24 h。

2.2 灌胃

2.2.1 灌胃时点 1 d组大鼠在造模结束大鼠苏醒后灌胃1次，3 d组大鼠每日灌胃1次共3次，7 d组大鼠每日灌胃1次共7次。

2.2.2 灌胃方法 造模成功后，各组均采用灌胃给药。中药给药剂量参照《药理实验方法学》[8]中“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算，中药组大鼠按照7.2 g/kg灌胃，假手术组及模型组大鼠采用与中药组相同剂量的蒸馏水在相同时间点灌胃，每日1次。

2.3 激光散斑对比成像技术检测脑血流变化

本实验参照Joseph S. Paul等[9]方法，利用激光散斑对比成像技术观察MCAO模型大鼠缺血半暗带脑血流变化。

2.3.1 检测时点 1 d组大鼠在造模后24 h、3 d组大鼠在造模后72 h、7 d组大鼠在造模后7 d分别进行脑血流检测。

2.3.2 检测方法 大鼠麻醉后俯卧位固定于脑立体定位仪上，剃去头部毛发，消毒后从头部正中剪开头皮及筋膜暴露颅骨，黑色记号笔在距前囟2 mm、中线左侧旁开2 mm处作一长轴约12 mm、短轴约6 mm的椭圆形，沿此椭圆边缘打磨颅骨，磨薄至硬脑膜外，用眼科镊在最薄处将该区域掀开，暴露骨窗作为血流检测部位，波长为671 nm的激光照射骨窗上，相机芯片上形成血管的动态散斑图(成像面积直径5 mm，曝光时间10 ms，帧频20 Hz，图像分辨率1024×1280)，采用matlab程序计算区域1/K2值的均值作为血流速度。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠脑血流变化

图1示，激光散斑对比成像伪彩色血流图显示，假手术组大鼠在各个时间点观测区血流量丰富，血流速度稳定(图中颜色越深红代表血流速度越快)；而大脑中动脉栓塞1 d后，模型组和中药组大鼠观测区血流速度下降明显；3 d和7 d时模型组大鼠脑血流未见明显恢复，而中药组在3 d时即见明显血流增加，7 d时血流伪彩图颜色加深，表明血流速度明显加快。

图1 各组大鼠伪彩色血流图

3.2 化痰通络法复方对MCAO模型大鼠相对脑血流影响

表1示，与假手术组比较，模型组1 d时脑血流速度明显降低，差异有统计学意义(P=0.000<0.05)；在3 d时，模型组脑血流速度继续降低，7 d时略有增加；中药组脑血流在1 d亦明显降低，但在3 d时即明显增高，血流速度明显高于模型组(P=0.000<0.05)，且高于假手术组(P=0.000<0.05)；7 d时中药组脑血流速度继续升高，明显高于模型组(P=0.000<0.05)和假手术组(P=0.000<0.05)。

表1 各组大鼠不同时间点相对脑血流速度平均值

注：与假手术组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

4 讨论

急性脑梗死发生后脑血流的改变是其特征性改变，也是引起脑梗死后脑损害的直接原因。重建和恢复半暗带血运，提高脑梗死后中断的血流供应，是治疗脑梗死的重要措施。大量临床研究证实，中医药疗法可有效改善急性脑梗死患者神经功能缺损症状[10-12]，实验研究也在揭示中医药疗法的作用机制[13-14]。研究表明，中医药疗法促进脑梗死患者恢复可能与改善脑血流有关。如临床研究发现，黄芪桂枝五物汤[15]、补阳还五汤[16]、逐瘀通络汤[17]等皆可有效改善脑梗死患者脑血流状况。而实验研究显示，梓葛冻干粉[18]、丹红注射液等可以明显改善急性脑梗死大鼠的脑血流。

对大脑血流的检测，不仅可以通过观察局部脑血流的速度加深对脑梗死病理过程的认识，还可以对脑梗死的治疗效果进行直观评价。目前临床中常用的脑血流检测方法有脑电图[19]、正电子发射断层成像[20]和功能性核磁共振成像[21]等，但是这些方法存在着空间分辨率和时间分辨率较低的缺点，且设备昂贵不适宜于基础研究。近年来，激光散斑对比度成像技术(laser speckle contrast analysis，LASCA)逐渐成为一种新兴的全景快速成像方法，在临床医学研究方面应用比较广泛[22-23]。它利用相干光照射在血管上，不仅可快速获得脑组织高时空分辨率的血管分布二维图像，同时也可定性显示血管内血液流动速度的变化[24-25]，已被越来越多地用来检测脑梗死后血流变化[9, 24]。

本研究中课题组采用激光散斑对比成像系统观察化痰通络法复方对大鼠脑梗死后脑血流的影响。研究结果发现，在大脑中动脉栓塞1 d后，模型组和中药组大鼠脑血流速度均下降至假手术组1/2左右，从脑血流变化情况说明造模成功。模型组大鼠脑血流速度在3 d时持续下降，7 d时脑血流速度与3 d时基本一致，均低于造模后1 d时，表明在未进行干预情况下，大鼠半暗带已经下降的脑血流未能得到及时、有效的恢复，符合脑梗死后缺血中心区和缺血半暗带动态变化的病理过程；而中药组大鼠在化痰通络法复方干预3 d后，脑血流不仅恢复甚至略高于正常水平，7 d时脑血流速度为正常水平的159%，表明化痰通络法复方可有效恢复并提高脑梗死后大脑血流速度。推测化痰通络法复方在治疗7 d时脑血流速度提升如此之高的原因与代偿供应、改善微循环和为满足脑梗死后脑血流供应有关。