地龙降压胶囊对自发性高血压大鼠凝血相关的血小板miRNAs的影响

王碧莹 李应东 刘永琦,2 张小平,2* 岳晓华 李长天 谢晓蓉 孙少伯

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室，甘肃 兰州 730000

地龙是传统中药，具有通经活络的功效，常用于治疗经脉不畅等病症。现代研究发现地龙具有抗凝血、改善血液循环等作用[1]。临床运用地龙降压胶囊治疗高血压有一定的疗效，但其降压机制尚不明确。研究表明老年性高血压和妊娠性高血压与血小板活化有一定的联系，此类高血压患者普遍处于高凝状态，血压升高时易引起血管内皮损伤，促使内皮细胞释放活性物质，引起血小板聚集，导致血小板血栓形成[2]。研究通过地龙降压胶囊对几种凝血相关的血小板miRNAs的影响，探讨其降压机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，8周龄，SPF级，雄性，实验期间给予标准饲料，自由饮食饮水。

1.1.2 仪器 QuantStudio 6实时荧光定量PCR仪(ABI)；Nano-100微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)；荧光定量PCR管(EXTRAGENE)；EDC-810 PCR仪(东胜创新生物科技有限公司)；JY300水平电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)；JY02S紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司)。

1.1.3 药物与试剂 地龙降压胶囊(批号：151026，甘肃中医药大学附属医院院内制剂)；Trizol(批号：15596-026，Ambion)；HiScript Reverse Transcriptase(批号：R101-01/02，VAZYME)；5×HiScript Buffer(批号：R101-01/02，VAZYME)；ddH2O(批号：C1D230A，genecopoeia)；Ribonuclease Inhibitor(批号：LOT#J11202，Tr-ansGen)；dNTP Mixture(批号：LOT#M1123，TIANGEN)；50×ROX Reference Dye 2(批号：Cat.#D01011A，VAZYME)；SYBR Green Master Mix(批号：Cat.#D01010A，VAZYME)。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药 参考文献[3]将SHR大鼠适应性喂养1周后测血压，按照收缩压值随机分为5组，每组8只：①正常对照组：等体积蒸馏水灌胃；②肝素阳性对照组：肝素500 IU/kg尾静脉注射，每日1次；③地龙降压胶囊低剂量组；④地龙降压胶囊中剂量组；⑤地龙降压胶囊高剂量组；以上三组参考文献[4]分别灌胃地龙降压胶囊25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg(胶囊内干粉溶于37℃温水)，每日2次，早晚各1次。以上各组共处理15 d后处死大鼠，取血液保存。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测mRNA Trizol法提取总RNA，逆转录成cDNA，8倍稀释后应用qPCR检测血小板相关5种miRNAs变化水平，计算公式为Folds=2-△△Ct，其中△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因，△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组。引物序列表如表1所示。

表1 引物序列

2 结果

2.1 miRNA-223的表达 各组的熔解曲线为单峰，没有出现杂峰和主峰的异常增宽，说明模板浓度合理；扩增曲线提示扩增效率良好。研究发现miRNA-223能够作用于P2Y12蛋白从而激活血小板的活化功能[5-6]，其表达量下降时抗凝血功能增强。由图1可知，地龙降压胶囊高剂量组的miRNA-223的表达量比正常对照组显著降低(正常：高剂量，1∶0.539)(P<0.01)，肝素阳性对照组的miRNA-223也出现类似的情况，提示药物干预会造成血小板活性降低。

2.2 miRNA-96的表达 研究发现囊泡相关膜蛋白-8(vesicle associated membrane protein8，VAMP-8)可激活血小板的活化，miRNA-96可通过降低其含量抑制血小板活化[7]，其表达上调具有抗凝血的作用。由图2可知，地龙降压胶囊高、中、低剂量干预后miRNA-96表达量分别是正常对照组的7.56、4.45、2.46倍(P<0.01)，可能药物干预后血小板的活化被抑制。

2.3 miRNA-130a的表达 体内外研究表明，糖蛋白Ⅱb可促进血小板的聚集，miRNA-130a通过减少其基因表达从而影响血小板的聚集过程[8]。由图3可知，肝素阳性对照组和地龙降压胶囊高剂量组的miRNA-130a表达量明显升高，分别是空白组的5.989倍、5.495倍(P<0.01)，说明地龙降压胶囊对血小板的聚集明显有抑制作用。

2.4 miRNA-155的表达 miRNA-155在造血干细胞中过表达能抑制巨核细胞生成、分化，从而抑制血小板产生[9]。由图4可知，与空白对照组相比，其余各组的miRNA-155表达量无明显差异(P>0.05)，分别是1.136、0.983、1.717、1.054，证明地龙降压胶囊对血小板产生没有抑制性影响。

2.5 miRNA34a-5p的表达 ICHIMURA等发现miRNA34a-5p能促进巨核细胞生成，从而提高血小板生成[10]。由图5可知，地龙降压胶囊高中低剂量干预组miRNA34a-5p的表达量跟正常对照组相比均无统计学差异(P>0.05)，可能地龙降压胶囊对血小板的生成无促进作用。

3 讨论

地龙别名蚯蚓，《本草纲目》记载：“性寒而下行，性寒故能解诸热疾，下行故能利小便，治足疾而通经络也”。此药归肝、脾、膀胱经，能通络平喘，适用于多种原因导致的经络阻滞、血脉不畅等症状。

高血压患者常伴有凝血功能的改变，周身微小血管暴露在高血压病理状态下，易出现内皮细胞结构改变和功能失调，进而促进血小板的活化作用[11]。研究发现高血压患者的平均血小板体积(MPV)增大，血压与MPV成正比，代表血小板活性增强[12]，加速血栓形成。目前，SHR是最接近人类原发性高血压病的动物模型，其特点为高血压自发率100%，在4～6周龄期间自发形成高血压，并且表现出持续性的血压增高，6个月可至最高水平。既往研究发现，SHR动物模型与人类原发性高血压的病理基础相似，存在高凝及纤溶亢进状态[13-14]。因此，本实验选用SHR为研究对象进行探讨。

地龙降压胶囊的主要成分为地龙蛋白提取物，具有溶血栓和抗凝血功效[15]。富含纤维蛋白溶解酶、蚓激酶、蚓胶原酶等，影响体内的凝血系统[16]。本研究中将miRNAs作为指标来监测地龙降压胶囊对血小板的影响，研究首先涉及与血小板活化作用相反的两种miRNAs：miRNA-223通过Ago2-mir-223复合物调节P2Y12(腺苷二磷酸受体)的表达，从而启动血小板的活化[17]，而miRNA-96可以通过降低VAMP-8的含量降低血小板的活化[18]。地龙降压胶囊干预后miRNA-223的表达量下降(见图1)，miRNA-96的表达上调(见图2)，表明地龙降压胶囊对血小板的活化有一定抑制作用，通过对血小板活化的抑制抗凝血。对miRNA-130a的检测发现，其表达明显上调(见图3)，miRNA-130a是通过抑制转录因子MAFB的表达，减少糖蛋白Ⅱb基因表达，从而抑制血小板的聚集[19]。结果说明地龙降压胶囊可能通过促进miRNA-130a的表达，进而抑制血小板的聚集。

另外，研究也涉及到与血小板生成相关的两种miRNAs：miRNA-155和miRNA34a-5p。miRNA-155通过抑制巨核细胞的生成、分化，从而抑制血小板产生，而miRNA34a-5p通过促进巨核细胞生成的途径提高血小板生成。研究表明，地龙降压胶囊干预后，miRNA-155和miRNA34a-5p的表达没有明显变化(见图4和5)，表明地龙降压胶囊可能对血小板的产生既无抑制作用也无促进作用，说明地龙降压胶囊没有通过影响血小板生成发挥抗凝血作用。

综上，地龙降压胶囊主要引起血小板活化和聚集相关的miRNAs的表达改变，而与血小板生成相关的miRNAs没有太大变化，证明地龙降压胶囊可能主要通过抑制血小板活化与聚集而降低凝血作用，进而发挥降压机制。进一步探讨miRNAs在凝血中的作用，尤其是对于与凝血异常相关的老年性高血压的控制有一定的临床意义。