稳尿胶囊对大鼠膀胱过度活动症的治疗作用及机制研究

王丹妮，张 宸，高贤娴，洪 铁,2*，王小龙

(1.吉林大学药学院药理教研室，长春130021；2.吉林省中医药科学院，长春130012；3.吉林省妇幼保健院，长春130061）

膀胱过度活动症（Overactive Bladder，OAB）是一种以尿急为主要特征的伴有尿频、夜尿、可伴或不伴急迫性尿失禁的临床常见泌尿系统疾病。在尿流动力学上可表现为膀胱逼尿肌过度活动，也可为其它形式的尿道与膀胱功能障碍。引起膀胱过度活动的主要原因为膀胱出口梗阻（Bladder outlet obstruction，BOO），即膀胱颈和/或尿道由于多种原因引起的尿道缩窄导致排尿困难。目前还未能发现针对性治疗膀胱过度活动症的药物及疗法，多以改善症状为主。稳尿胶囊是吉林省中医药科学院泌尿外科专家以传统中医药理论为指导根据长期临床实践总结出的经验方，对机体的泌尿系统、免疫系统、消化系统具有较好的调节作用，可用于治疗具有膀胱过度活动症状的泌尿系统疾病。在具有膀胱出口梗阻病变的一类疾病中，梗阻的发生部位绝大部分位于膀胱颈及近端尿道，例如男性良性前列腺增生症、女性产后膀胱颈梗阻等。因此本研究选用结扎膀胱-近端尿道连接处的大鼠膀胱出口梗阻模型模拟人类膀胱过度活动症以研究稳尿胶囊对膀胱过度活动症的治疗作用。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SPF级SD 大鼠，雌性，60只，体质量220～240g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2015-0001，将动物于动物室适应性饲养一周，温度为20～24℃，湿度为40%～70%，12h明暗交替照明，给予维持饲料，自由饮水。

1.2 实验试剂

酒石酸托特罗定片由山东鲁南贝特制药有限公司生产；大鼠神经生长因子（NGF）ELISA试剂盒由武汉默沙克生物科技有限公司生产；大鼠白细胞介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供；丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA法）、总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（WST-1法）由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 实验仪器

BL-420E+生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司；科耐普计量智能型恒流泵，重庆科耐普蠕动泵有限公司；全波长酶标仪，Biotek公司；手持式高速匀浆机，上海巴玖实业有限公司；BS124S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；3-18k低温高速冷冻离心机，Sigma公司；XPX-9052 MBE数显不锈钢电热培养箱，上海博迅实业有限公司。

2 方法

2.1 动物模型的建立与分组给药

将60只SD雌性大鼠，按体重随机分为6组，正常对照组6只，膀胱梗阻模型（BOO）组14只，其余各给药组各10只，分别为稳尿胶囊高剂量组（5.4mg/kg），稳尿胶囊中剂量组（2.7mg/kg），稳尿胶囊低剂量组（1.35mg/kg），阳性对照托特罗定片（0.5mg/kg）组。大鼠分笼饲养，常规饮食饮水。

大鼠行膀胱梗阻手术模拟大鼠膀胱过度活动症。腹腔注射10%水合氯醛 （0.3ml/100g）对大鼠进行麻醉，麻醉成功后仰卧位固定大鼠于动物手术台，消毒腹部及会阴部，取硬膜外麻醉导管自制导尿管经尿道插入膀胱并固定，用以支撑尿道。沿骨盆趾骨上缘做下腹部正中切口，逐层剪开皮肤、腹直肌层及腹膜，推开覆盖的子宫和附着的脂肪，显露膀胱，沿膀胱向下，稍分离筋膜显露膀胱颈及近端尿道，手术弯针带4-0丝线穿过膀胱颈周围韧带，在靠近膀胱颈-近端尿道处进行结扎，丝线结扎力度以能滑动尿道中导管并带动周围组织为度。以上操作均为同一术者实施。假手术组采用相同术式但不做结扎处理，其余操作相同。结扎后移除导尿管，逐层缝合下腹部切口，局部用碘伏消毒后，腹腔内注射青霉素80万U/只，大鼠保持体温，完全复苏后放回笼中。术后3天大鼠给予同等剂量青霉素抗感染，早晚各一次，并观察大鼠下腹部伤口和排出尿液情况。术后第4天开始给药，给药组按组别灌胃给予不同浓度受试药，每日1次连续6周，假手术组及BOO组灌胃给予同等体积蒸馏水。

2.2 观测指标

2.2.1 大鼠一般状态

实验期间观察大鼠一般状态，包括体重、排尿情况、毛发、精神状态等。

2.2.2 大鼠尿流动力学指标测定

末次给药2h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰卧位固定大鼠，消毒腹部及会阴部，沿腹部原创口位置做一切口，完全暴露膀胱，将膀胱颈周围脂肪、增生组织分离，将膀胱口-近端尿道结扎线拆除，经尿道口插入导尿管导出膀胱内尿液。用镊子轻提膀胱顶端，眼科剪在顶端做一小孔，将两根PE-50软管（内径0.58mm外径0.96mm）经小孔插入膀胱内部约5mm深，固定软管，软管1连接压力换能器后连接BL-420E+生物机能实验系统，软管2连接蠕动泵，排净系统内残留空气后调零，轻压膀胱排出多余尿液，将此时的膀胱压力调至基线。系统稳定后，膀胱灌注温生理盐水（灌注速度为0.1ml/min），看见有尿液流出立即停止灌注，记录尿流动力学波形图及排尿点压PT（mmHg）、排尿压峰值 MP（mmHg）。至少记录 3 个排尿周期。

收集排出尿液称量体积UV（ml），测定结束时导尿管连接注射器将膀胱中残余尿液吸出，记录剩余尿量 RV（ml），计算膀胱容量 TUV（ml）:

TUV(ml)=UV(ml)+RV(ml)

实验结束后取大鼠膀胱组织，称重记录膀胱湿重（mg），计算膀胱指数：

膀胱指数 （%）=膀胱湿重 （mg）/大鼠体重（g）x100%

2.2.3 大鼠尿液中NGF含量测定

大鼠尿液静置1h后离心分离上清，离心条件4℃下，4000r/min，10 min，-80℃冻存备用。采用 ELISA 法严格按照说明书的指导测定大鼠尿液中神经生长因子NGF的含量变化。

2.2.4 大鼠膀胱组织中SOD、MDA、IL-1β的含量测定

取大鼠膀胱组织，液氮速冻后转-80℃冻存备用。取适量膀胱组织，加入冰生理盐水，置于冰浴中用组织匀浆器制成膀胱组织匀浆，离心取上清液，离心条件4℃下，3500 r/min，10 min。 取适量上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书的要求测定膀胱组织上清液中IL-1β含量，严格按照试剂盒说明书的要求测定膀胱组织上清液中SOD、MDA含量。

2.3 统计学处理

全部实验数据均采用SPSS 17.0软件进行。根据检验数据资料的正态性和方差齐性，各组数据均用x±s表示，组间比较采用t检验比较差异的显著性。P＜0.05即有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般状况及膀胱形态变化

建立模型早期大鼠进食量稍减，体重稍减，后期恢复正常。实验结束后观察各组大鼠膀胱形态，假手术组膀胱大小正常，表面略粉色，触之有弹性；BOO组膀胱明显增大，表面被膜充血，颜色较深，触之较硬，膀胱壁明显增厚，留存尿液增多。其余各给药组膀胱形态有不同程度恢复。

（上图为膀胱出口梗阻大鼠膀胱形态变化示意图）

3.2 大鼠尿流动力学指标测定结果

假手术组大鼠膀胱充盈期呈低压状态，排尿期膀胱压升高随排尿活动进行而逐渐降低，具有规律的尿流动力学波形；与假手术组相比，BOO组大鼠膀胱充盈期出现逼尿肌不稳定收缩，收缩频率明显增高，形成不规则的锯齿状图形；与BOO组相比各浓度给药组波形有不同程度的改善，其中稳尿胶囊高剂量组与阳性药组更接近于假手术组尿流动力学波形，详见图1。与假手术组相比，BOO组大鼠排尿点压力MP升高、排尿压峰值PT升高、膀胱剩余尿量RV增多、排除尿量UV减少、膀胱容量TUV减小（未列出）、膀胱湿重增加（未列出）、膀胱指数升高，均有显著性差异（P＜0.01）；与BOO组相比，稳尿胶囊高剂量组和阳性对照组可降低PT、MP，使RV减少UV增加，降低膀胱重量及膀胱指数，均具有显著性差异（P＜0.01）。尿流动力学指标测定结果见表1。

图1 稳尿胶囊对BOO大鼠尿流动力学影响结果

表1 稳尿胶囊对BOO大鼠尿流动力学指标及膀胱指数的影响结果（x±s）

3.3 大鼠体内NGF、SOD、MDA、IL-1β含量测定结果

与假手术组相比，BOO组大鼠尿液NGF含量显著增加（P＜0.01），膀胱组织上清液中 MDA、IL-1β 含量增加 （P＜0.05，P＜0.01），SOD 含量显著减少 （P＜0.01）；与BOO组相比，稳尿胶囊高剂量组和阳性对照组大鼠尿液NGF含量显著降低，膀胱组织上清液中 MDA、IL-1β 含量降低（P＜0.01，P＜0.05），SOD 含量显著升高（P＜0.01），结果见表 2。

表2 稳尿胶囊对BOO大鼠大鼠体内各因子含量的测定结果（x±s）

4 讨论

膀胱过度活动症（overactive bladder，OAB）是由膀胱逼尿肌的过度活动引起的以尿频、尿急、尿不尽为主要症状的的常见泌尿外科疾病，引起OAB的原因多为下尿路梗阻、膀胱持续处于刺激状态及膀胱-尿道炎症等[1]。OAB患者膀胱逼尿肌的过度活动会导致膀胱频繁无规律性收缩，使膀胱丧失储尿功能，频繁引起尿意，并且可随着患病时间增长而引起其他尿道—膀胱功能障碍，提示下尿路梗阻是引起逼尿肌不稳定的主要原因。膀胱出口梗阻 (Bladder outlet obstruction，BOO)可引起膀胱组织结构改变，表现为膀胱增大肥厚失去弹性使顺应性降低，导致排尿期压力降低，使尿液潴留而导致下尿路梗阻和膀胱持续刺激症状。本文采用大鼠BOO模型模拟梗阻后膀胱的异常变化，常用于模拟人类OAB膀胱病变过程。

尿液中神经生长因子 （nerve growth factor，NGF）的含量测定是近年来临床研究最多的无创诊断OAB的方法，有望替代尿流动力学监测以快速诊断OAB。已有许多研究显示NGF直接参与OAB发病过程及症状表现[2]。尿液NGF主要由膀胱上皮细胞表达。许多研究表明OAB患者尿液中NGF表达升高[3～4]，在膀胱平滑肌和黏膜组织中分泌明显增加[5]。本实验中大鼠尿液NGF的表达升高提示膀胱处于过度活动状态，可作为判断实验性OAB模型成功的指标。白细胞介素-1β是常见的致炎因子，已有研究表明膀胱炎症反应和IL-1β是BOO引起膀胱逼尿肌过度活动的核心通路，已被证实IL-1β可直接刺激膀胱逼尿肌，介导膀胱炎症反应[6]。BOO发生后膀胱会进行周期性缺血-再灌注，产生很多氧化应激因子造成膀胱黏膜损伤，这些氧化应激因子可与脂质反应生成大量过氧化产物丙二醛附着于膀胱黏膜表面使粘膜通透性增加。超氧化物歧化酶是抗氧化反应的关键酶，可清除氧自由基，调节膀胱内氧化应激因子含量，降低BOO引起的膀胱缺血-再灌注损伤。已有研究证实兔膀胱发生BOO后，膀胱MDA含量增加、SOD活性降低[7]。

稳尿胶囊是根据多年治疗OAB及具有BOO症状的泌尿道疾病的临床经验而总结出的经验方，具有利尿排毒、益气固本的作用。组方中的君药黄芪作为利水药材多用于治疗膀胱过度活动症[8]，具有补气固表，托毒排脓，利尿生肌的作用，也常用来治疗自汗水肿、慢性肾炎蛋白尿、糖尿病等疾病。已有研究表明，黄芪可改善逼尿肌不稳定大鼠下尿路症状[9]，抑制体外膀胱逼尿肌收缩频率和张力[10]。综上，稳尿胶囊可能通过改善尿流动力学、抑制NGF表达、抑制膀胱炎症及氧化-应激反应等治疗膀胱过度活动症，其具体作用机制还有待进一步研究。