稳尿胶囊对环磷酰胺诱导的大鼠膀胱过度活动症的治疗作用研究

高贤娴，王丹妮，张 宸，洪 铁,2*，王小龙*

(1.吉林大学药学院药理教研室，长春130021；2.吉林省中医药科学院，长春130012；3.吉林省妇幼保健院，长春130061）

膀胱过度活动症（overactive bladder，OAB）是一种临床常见的以尿频、尿急、夜尿等为主要膀胱症状的泌尿外科疾病，可伴或不伴急迫性尿失禁，严重时可出现血尿。通常可由下尿路梗阻、急慢性膀胱炎、神经源性膀胱炎及间质膀胱炎等多种病因引起，国际尿控协会将OAB定义为膀胱逼尿肌不自主收缩；尿流动力学可表现为膀胱逼尿肌过度活动。近年来发现其发病率可随年龄增长而升高，老年人群多发且女性高于男性[1]。目前并无特异性治疗药物及疗法。稳尿胶囊是吉林省中医药科学院泌尿外科专家以传统中医药理论为指导，根据长期临床实践总结出的经验方。全方由黄芪、山药、党参、炒白术、茯苓、泽泻、土茯苓等七味草药组成，对机体的泌尿系统、免疫系统、消化系统具有较好的调节作用。环磷酰胺（Cytoxan，CTX）是广泛应用的广谱抗肿瘤药，在治疗各种实体瘤的同时由体内磷酸脱氢酶转变为丙烯醛沉积在膀胱粘膜及尿道上皮，导致泌尿道毒性从而引起出血性膀胱炎，表现为少尿、血尿及尿频尿急等膀胱刺激症状[2]。因其引起的膀胱症状与人膀胱过度活动症相似，已成为由化学物质刺激引起的膀胱过度活动症的首选模型。本实验选用腹腔注射环磷酰胺建模以研究稳尿胶囊对大鼠膀胱过度活动症的治疗作用及其机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，雄性，60只，体质量250～280 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2015-0001，将动物于动物室适应性饲养一周，温度为20～24℃，湿度为40%～70%，12h明暗交替照明，给予维持饲料，自由饮水。

1.2 实验试剂

环磷酰胺由上海信裕生物科技有限公司提供；酒石酸托特罗定片由山东鲁南贝特制药有限公司生产；大鼠神经生长因子 （NGF）ELISA试剂盒由武汉默沙克生物科技有限公司生产；大鼠白细胞介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供；丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA法）、总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（WST-1法）由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 实验仪器

BL-420E+生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司；科耐普计量智能型恒流泵，重庆科耐普蠕动泵有限公司；全波长酶标仪，Biotek公司；手持式高速匀浆机，上海巴玖实业有限公司；BS124S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；3-18k低温高速冷冻离心机，Sigma公司；XPX-9052 MBE数显不锈钢电热培养箱，上海博迅实业有限公司。

2 方法

2.1 分组给药与动物模型的建立

将60只SD雄性大鼠，按体重随机分为6组，正常对照组6只，环磷酰胺（75mg/kg）模型组14只，其余各给药组各10只，分别为稳尿胶囊高剂量组（5.4mg/kg），稳尿胶囊中剂量组（2.7mg/kg），稳尿胶囊低剂量组（1.35mg/kg），阳性对照托特罗定片（0.5mg/kg）组。大鼠分笼饲养，常规饮食饮水。

采用大鼠腹腔注射环磷酰胺（75mg/kg）模拟大鼠膀胱过度活动症模型，每3日/1次，共4次。造模1h后分别灌胃给予高、中、低浓度稳尿胶囊（1.35、2.7、5.4mg/kg）和阳性对照托特罗定（0.5mg/kg），1 次/日，连续给药14天。

2.2 观测指标

2.2.1 大鼠一般状态

实验期间观察大鼠一般状态，包括体重、毛发、精神状态、口鼻出血、尿血等表现。

2.2.2 大鼠尿流动力学指标测定

末次给药后对大鼠进行尿流动力学指标检测。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后仰卧位固定，腹部及尿道口消毒，用硬膜外麻醉导管自制大鼠导尿管，大鼠做尿道插管导出膀胱余尿后固定导尿管。沿大鼠趾骨弓上缘向上纵向剖开腹部暴露膀胱，在膀胱顶部刺一小洞，将两根PE-50导管插入膀胱，荷包缝合使导管固定于膀胱且无漏尿。造瘘管1与BL-420E+生物机能实验系统相连，造瘘管2与蠕动泵相连，系统排尽残留空气后调零，轻压腹部排净尿液，将膀胱基础压力调整至基线。膀胱灌注温生理盐水（灌注速度为0.1ml/min）。记录尿流动力学波形图及排尿压峰值（mmHg）、排尿间隔时间（s）。至少记录3个排尿周期。

测定结束时导尿管连接注射器将膀胱中残余尿液吸出，记录剩余尿量（ml）。

实验结束后取大鼠膀胱组织，称重记录膀胱湿重（mg），计算膀胱指数：

膀胱指数 （%）=膀胱湿重 （mg）/大鼠体重（g）x100%

2.2.3 大鼠血清中NGF含量测定

尿流动力学测定后大鼠经腹主动脉取血，离心分离上清，-80℃冻存备用。采用ELISA法严格按照说明书的指导测定大鼠血清中神经生长因子的含量变化。

2.2.4 大鼠膀胱组织中SOD、MDA、IL-1β的含量测定

取血后取大鼠膀胱组织，液氮速冻后转-80℃冻存备用。取适量膀胱组织，加入冰生理盐水，置于冰浴中用组织匀浆器制成膀胱组织匀浆，离心取上清液，离心条件4℃下，3500 r/min，10 min。取适量上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书的要求测定膀胱组织上清液中IL-1β含量，严格按照试剂盒说明书的要求测定膀胱组织上清液中SOD、MDA含量。

2.3 统计学处理

全部实验数据均采用SPSS 17.0软件进行。根据检验数据资料的正态性和方差齐性，各组数据均用x±s表示，组间比较采用t检验比较差异的显著性。P＜0.05即有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般状况

造模大鼠出现不同程度全身症状，如体质量下降，进食量减少，毛色暗淡大量脱毛，精神萎靡懒动，口鼻眼渗血，出现肉眼尿血。各给药组全身症状有不同程度改善。

3.2 大鼠尿流动力学指标测定结果

对照组大鼠膀胱充盈期呈低压状态，排尿期膀胱压明显升高随排尿活动进行而逐渐降低，具有规律的尿流动力学波形；与对照组相比，模型组大鼠膀胱充盈期出现逼尿肌不稳定收缩，收缩频率明显增高，形成不规则的锯齿状图形；与模型组性比各给药组波形有不同程度的改善，其中稳尿胶囊高剂量组与阳性药组更接近于正常组尿流动力学波形。各组尿流动力学波形见图1。与对照组相比，模型组大鼠排尿间隔时间缩短、排尿压峰值降低、膀胱剩余尿量增多、膀胱指数升高，均有显著性差异（P＜0.01）；与模型组相比，稳尿胶囊高剂量组和阳性对照组可延长排尿间隔时间、升高排尿压峰值、使膀胱残余尿量减少，均具有显著性差异（P＜0.01），可降低膀胱指数（P＜0.05）。 尿流动力学指标测定结果见表1。

图1 稳尿胶囊对膀胱过度活动大鼠尿流动力学影响结果

表1 稳尿胶囊对膀胱过度活动大鼠尿流动力学指标及膀胱指数的影响结果（x±s）

3.3 大鼠体内NGF、SOD、MDA、IL-1β含量测定结果

与对照组相比，模型组大鼠血清中NGF含量显著增加（P＜0.01），膀胱组织上清液中 MDA、IL-1β 含量显著增加（P＜0.01，P＜0.05），SOD 含量显著减少（P＜0.01）；与模型组相比，稳尿胶囊高剂量组和阳性对照组显著降低大鼠血清中NGF含量，降低膀胱组织上清液中 MDA、IL-1β 含量（P＜0.01，P＜0.05），显著升高SOD含量（P＜0.01）。各因子测定结果见表2。

表2 稳尿胶囊对膀胱过度活动大鼠体内各因子含量的测定结果（x±s）

4 讨论

膀胱过度活动症（overactive bladder，OAB）是由膀胱逼尿肌的过度活动引起的以尿频、尿急、尿不尽、夜尿等症状为主、伴或不伴急迫性尿失禁的常见泌尿外科疾病，可由膀胱炎症、下尿路梗阻、前列腺炎、盆腔炎症等疾病引起。逼尿肌的过度活动常导致膀胱频繁无规律性收缩，使膀胱丧失储尿功能，随着患病时间增长可引起其他尿道—膀胱功能障碍。

尿流动力学检查是临床诊断膀胱过度活动症排尿功能障碍的重要手段，可客观反映膀胱与下尿道功能状态。本实验结果显示，模型组大鼠的尿流动力学曲线呈无规则锯齿状，提示膀胱逼尿肌无自主收缩频繁；排尿压峰值明显低于正常组大鼠，提示储尿期变短即排尿间隔时间缩短；排尿压降低使膀胱内剩余尿液不能完全排出致使剩余尿量增加。有文献报道称当膀胱逼尿肌常处于过度活跃状态可导致膀胱壁顺应性降低，出现尿失禁症状，而膀胱内持续的炎症刺激可导致膀胱壁水肿增厚，是膀胱顺应性降低的另一主要原因。环磷酰胺常用于模拟炎症引起的膀胱过度活动症模型，是广谱抗肿瘤药之一，其体内代谢物丙烯醛常沉积于膀胱及下尿路，持续刺激膀胱内壁引起炎症，是癌症患者并发出血性膀胱炎的首要原因。

神经生长因子（nerve growth factor，NGF）在膀胱上皮细胞及膀胱黏膜组织中均有表达，膀胱过度活动时可在血液及尿液中发现大量NGF。许多研究表明膀胱过度活动症患者血液及尿液中NGF表达升高，在膀胱平滑肌和黏膜组织中分泌明显增加[3]。尿液中NGF的表达升高提示膀胱处于过度活动状态，可有望成为无创确诊膀胱过度活动症的指标之一[4～5]。丙二醛、超氧化物歧化酶及白细胞介素-1β是常见的致炎因子，可导致膀胱炎症加剧引起膀胱过度活动症[6]。

稳尿胶囊是根据多年治疗膀胱过度活动症的临床经验而总结出的经验方，具有益气固本、散浊利尿的作用。组方中的君药黄芪具有补气固表、利尿排毒的作用，常用来治疗自汗、水肿、慢性肾炎蛋白尿等疾病。已有研究表明，黄芪可抑制体外膀胱逼尿肌收缩频率和张力，改善逼尿肌不稳定大鼠下尿路症状[7]。综上，稳尿胶囊可能通过改善尿流动力学、抑制NGF表达、抑制促炎因子表达等治疗膀胱过度活动症，其具体作用机制还有待进一步研究。