醋两头尖饮片质量标准研究

赵 凌，付 要，蔡广知*

（长春中医药大学·吉林长春·130117）

中药原药材大多都是未经过加工处理的药材，只有经过加工处理和炮炙后，才能更好的发挥增效减毒的作用。因此，在原药材符合质量标准的情况下，对其进行炮制，并制定质量标准，对临床而言，尤其重要[1～2]。

两头尖为毛茛科植物多被银莲花 （Anemone raddeana RegeL）的干燥根茎。夏季采挖，除去须根，洗净，干燥[3]。两头尖含有大量复杂的化学成分,迄今为止，从两头尖中已经分离并获得的化合物包括皂苷类、内酯类、挥发油类、油脂类、生物碱类及糖类等[4～9]。其性味辛、热，有毒，归脾经，有祛风湿、消痈肿的功效，用于治疗风寒湿痹、四肢拘挛、骨节疼痛、痈肿溃烂等，为治疗风湿病的要药[10～13]。醋两头尖饮片源自《再造丸》方剂，在2008版《北京市中药饮片炮制规范》[14]中被收载。现今，对醋两头尖饮片的研究较少，这对醋两头尖饮片的质量控制十分不利。因此，制定醋两头尖饮片质量标准对规范炮制饮片质量和保证临床疗效具有重要意义。

根据课题组前期实验基础[15]：醋两头尖饮片最佳炮制工艺为加20%米醋，闷润2 h，在120℃下进行翻炒，炒制 10 min。本实验采用最佳醋制工艺参数[16～17]，对10批不同来源的两头尖原药材进行炮制，制备炮制样品，并对其进行测定。根据研究结果，制定醋两头尖饮片的质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2030型高效液相色谱仪 (岛津科技有限公司)，AB135-S型1/10万电子天平，AL204型 1/1万电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，KQ3200DB型数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；HH-S24电热恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂）。

1.2 试剂与试药

米醋（市售，总酸≥90.0 g/L，以乙酸计）；乙腈、甲醇〔色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司〕；正丁醇、乙酸乙酯、甲酸、乙醇、浓硫酸、三氯甲烷（北京化工厂）；冰醋酸（西陇化工股份有限公司）；乙醚（天津天泰精细化学品有限公司）；水（屈臣氏蒸馏水）；竹节香附素A（RDA）标准品（中国食品药品检定研究院，批号：111712-201702，纯度≥98%）。10批两头尖来源信息见表1。

表1 10批两头尖来源信息

2 方法

2.1 醋两头尖饮片样品的制备

取10批不同来源的两头尖原药材，净制，除去杂质，称取适量，加米醋20%，均匀搅拌，闷润2 h，置于炒锅内，设置炒制温度为120℃，翻炒10 min，取出，晾凉，即得。

2.2 性状外观

对10批醋两头尖饮片样品进行外观性状观察，观察结果如图1-2所示。

2.3 显微鉴别

分别取10批醋两头尖饮片样品，依次用粉碎机粉碎过四号筛。取少量醋两头尖饮片样品粉末于载玻片上，加入2～3滴水合氯醛溶液，盖上盖玻片。于显微镜下观察，观察结果如图3-6所示。

2.4 薄层色谱鉴别

2.4.1 标准品溶液的制备

精密称定RDA标准品5.00mg，置于5ml量瓶中，加甲醇溶解，并定容至5ml，制成每1ml含1mol RDA的溶液，得到标准品溶液。

2.4.2 供试品溶液的制备

取本品粉末(过三号筛)约5g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流提取3h，提取液回收溶剂至干，残渣加水10ml溶解，用乙醚振摇提取2次(20ml、10ml)，弃去乙醚液。用水饱和的正丁醇振摇提取5 次(20ml，20ml，15ml，15ml，15ml)，合并正丁醇液，减压回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.3 薄层色谱方法

照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述供试品溶液和对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶1）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热5min，于日光下检视。结果见图7-9。

2.5 水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物测定

参照2015版《中国药典》，对10批醋两头尖饮片样品的水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物进行测定，结果见表4。

2.6 含量测定

2.6.1 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱；检测波长为206nm。进样量为5μl，理论板数按竹节香附素A峰计算应不低于4000。

表2 梯度洗脱

2.6.2 标准品溶液的制备

按“2.4.1”项标准品溶液制备方法制备。

2.6.3 供试品溶液的制备

按“2.4.2”项供试品溶液制备方法制备。

2.6.4 线性

分别精密吸取浓度为4mg/ml的RDA标准品溶液依次稀释，各置于1ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度分别为 4、2、1、0.5、0.25mg/ml的一系列溶液。分别吸取5μl进样测定，以峰面积（A）为纵坐标，样品浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：Y=1746613.9780 x-83681.6667 （r=0.9994），在0.25～4.00mg/ml浓度的RDA与峰面积线性关系良好。

2.6.5 精密度实验

取“2.4.2”项下供试品溶液，重复进样6次，每次5μl，按“2.6.1”项下色谱条件测定，计算6次RDA峰面积RSD=0.89%，表明仪器精密度良好。

2.6.6 稳定性实验

按“2.4.2”项供试品溶液制备方法制备，分别放置0、4、8、12、24h 后进样，进样量 5μl，按“2.6.1”项下色谱条件测定，计算RDA峰面积RSD=1.49%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.6.7 重复性实验

称取同批样品6份，按“2.4.2”项供试品溶液制备方法制备，分别进样 5μl，按“2.6.1”项下色谱条件测定，计算RDA峰面积RSD=1.26%，表明方法重复性良好。

2.6.8 加样回收率实验

取已知含量的供试品溶液9份，按 1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5加入相当于两头尖提取液中含有量的RDA标准品，各平行3次，按“2.4.2”项供试品溶液制备方法制备，按“2.6.1”项下色谱条件测定，分别进样 5μl，结果如表3所示。计算平均回收率为100.03%，RSD=2.73%，结果表明本法回收率良好。

表3 回收率实验结果

2.6.9 样品测定

取10批醋两头尖饮片粉末5g，精密称定，每批样品平行称取2份，按照“2.4.2”项供试品溶液制备的方法制备，每一份样品进样2次进行测定。对10个批次的醋两头尖饮片样品进行测定，测定结果见表5。

3 结果

3.1 外观性状

观察10批醋两头尖饮片，得出结论：醋两头尖饮片呈类长纺锤形，两端尖细，微弯曲，其中近一端处较膨大，长1～3cm，直径2～7mm。外皮棕褐色至棕黑色，具微细纵皱纹，膨大部位常有1～3个支根痕呈鱼鳍状突起，偶见不明显的3～5环节。质硬而脆，易折断。切面棕色或棕红色，略平坦。稍具醋酸气味。

图1 -2醋两头尖外观性状照片

3.2 显微鉴别

粉末灰褐色。淀粉粒众多，单粒类圆形或椭圆形，直径2～11μm，脐点点状或短缝状，层纹不明显；复粒由2～4分粒组成。表皮细胞红棕色、黄色或亮黄色，外壁木栓化增厚，常呈脊状或瘤状突入细胞内。网纹导管、螺纹导管或梯纹导管多见，直径10～33μm，少有具缘纹孔导管。

图3 醋两头尖淀粉粒

图4 醋两头尖薄壁细胞

图5 醋两头尖导管（螺纹导管）

图6 醋两头尖导管（具缘纹孔导管）

3.3 薄层色谱鉴别

10批醋两头尖薄层色谱鉴别结果如图7-9所示，该方法可以很好的鉴别醋两头尖饮片。

图7 -9醋两头尖饮片薄层色谱图（从左至右依次为RDA标品、S1-S10）

3.4 水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物限度制定

根据10批醋两头尖饮片实验测定结果，如表4所示。按平均值的±20%作为限度制定幅度。规定醋两头尖饮片水分不得过10.2%，总灰分不得过4.0%，酸不溶性灰分不得过0.7%，浸出物不得低于11.8%。

表4 水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物结果

3.5 含量测定限度制定

根据本品10批醋两头尖饮片含量测定结果，如表5所示。10批样品平均值为0.22%，并参照2015版《中国药典》中规定的含量限度，下浮20%。因此，RDA的含量不得少于0.18%。

表5 含量测定结果

4 讨论

本实验根据课题组前期实验方法和最佳工艺参数的基础上，对收集的10批两头尖药材进行炮制加工，对制备的醋两头尖饮片进行外观性状、显微鉴别、薄层色谱鉴别实验；对水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物进行测定，制定限度，规定醋两头尖饮片水分不得过10.2%，总灰分不得过4.0%，酸不溶性灰分不得过0.7%，浸出物不得低于11.8%；对有效成分RDA含量进行测定，制定限度，规定RDA含量不得少于0.18%。本研究可以为建立醋两头尖饮片的质量控制标准提供依据[18～19]。