TLR4Asp299Gly、Thr399Ile基因多态性与梅毒的相关性

罗丽 张鑫 胡洁 张信江

1遵义医科大学附属医院皮肤科（贵州遵义563003）；2平顶山市第二人民医院皮肤科（河南平顶山467000）

梅毒是梅毒螺旋体感染引起的性传播疾病，主要通过性接触传播，随着改革开放及社会经济的发展，梅毒患者也不断增多，严重威胁人类的身心健康［1-2］。目前梅毒的发病机制尚未完全阐明，大量研究表明，人在感染梅毒螺旋体后，体内发生一系列复杂的体液和细胞免疫过程，导致患者血管通透性增加，感染部位聚集多种炎症细胞，对早期梅毒螺旋体的清除有利［3-5］。Toll 样受体TLRs（Toll like receptors，TLRs）是近年来发现的新型细胞受体家族，它通过识别病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）介导跨膜信号传递，能够激活多种炎症因子的表达［6-8］。目前对梅毒与TLRs 受体家族的相关研究的报道相对较少。有研究显示，TLR2 在梅毒感染机体免疫识别信号转导过程中起着一定的作用［9-10］。目前研究较多的是TLR2 两个SNP 位点Arg677Trp 和Arg753Gln 多态性与感染性疾病的关系，有研究表明TLR2 Arg677Trp 多态性在牙周炎患者中呈高检出率［11］。国内仅发现有学者对梅毒患者与Toll 样受体2 基因单核苷酸多态性研究［12］，但是目前并未发现有关于梅毒与TLR4 基因多态性的相关性研究报道。

作为TLRS 家族中要的成员，目前发现TLR4基因在编码区至少存在+896A/G 与+1196C/T 两个特征性单核苷酸多态性位点，即Asp299Gly 和Thr399Ile，但是尚未见关于TLR4 基因多态性与梅毒相关性的报道［13］。本研究旨在探讨TLR4 的基因Asp299Gly 和Thr399Ile 的多态性与梅毒的关系，以期为阐明梅毒易感性和先天性免疫机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料在知情同意和伦理道德原则下，选择2012～2014年在本院皮肤性病门诊及其他科住院筛查确诊的梅毒患者120 例为实验组，经TPPA、TRUST 试验检测均阳性，TRUST 滴度1∶1 ～160；未合并其他性传播疾病。包括显性梅毒53 例（一期24 例，二期29 例），隐性梅毒67 例（TPPA 和TRUST 试验检测均阳性，无任何症状和体征，并随访3 个月以上）。实验组再分为两组，一组（60 例）为性伴侣或夫妻双方中有1 人发病者，年龄20 ～60 岁，平均39.2 岁，另一组（60 例）为性伴侣或夫妻双方共同发病者，年龄23 ～62 岁，平均37.4 岁。选择近期无细菌、真菌、病毒等各种感染的健康人60 例为对照组，年龄18 ～45 岁，平均34.3 岁。梅毒诊断须根据病史、临床症状、体检及实验室检查等综合分析。一期梅毒临床表现为硬下疳和腹股沟或患部近位淋巴结肿大。二期梅毒表现为多形性皮疹，常泛发对称，自觉症状轻微。三期梅毒常见结节性皮疹及皮肤、黏膜、骨骼树胶肿等。

1.2 外周血基因组的提取无菌操作下对研究对象各抽取外周血5 mL，EDTA 抗凝，室温下3 000 r/min离心10 min 提取白细胞层。使用Ezup 柱式血液基因组DNA 抽提试剂盒提取mtDNA，具体操作步骤依据试剂盒说明书。

1.3 Asp299Gly和Thr399Ile的PCR扩增和产物电泳鉴定引物由上海生工程公司设计合成，采用上海生物工撑公司PCR 扩增试剂盒按，配制成25 μL PCR 反应体系，PCR 后对产物进行电泳鉴定。Asp299Gly 引物序列为：上游：5′-GATTAGCATACT TAGACTACTACCTCCATG-3′；下游：5′-GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3′。Thr399Ile 引物序列为：上游：5′-GGTTGCTGTTCTCAAAGTGATTTT GGGAGAA-3′；下游：5′-CCTGAAGACTGGAGAGTG AGTTAAATGCT-3′。

1.4 测序及结果分析将PCR 产物寄往上海生物工程公司进行纯化、测序及拼接。将拼接序列与NCBI 中TLR4 的全基因序列进行比对，查看变异碱基位置并统计记录，根据统计结果比较实验组与对照组，观察所测位点是否存在高突变碱基位点。

1.5 统计学方法将实验组和正常对照组的测序结果与剑桥序列进行比对后，统计两组中突变的位点及突变频率后作χ2检验，采用SPSS 19.0 进行统计学分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组及对照组Asp299Gly和Thr399Ile PCR产物的电泳结果结果显示，分子量标准物条带最亮为500 bp，DNA 浓度约为150 ng，Asp299Gly 片段PCR 产物大小为249 bp，Thr399Ile 片段PCR 产物大小为406 bp，符合测序要求。图1A、图1B 分别为Asp299Gly 片段和Thr399Ile 片段PCR 产物一人患病组和夫妻同患组各随机抽取5 个样本电泳图，M 为DNA Marker（DL 1 000 bp），条带1、2、3、4、5 为一人患病组样本，6、7、8、9、10 为夫妻同患组样本。图1C 为随机抽取的3 个对照组样本电泳图，条带1、2、3 为Asp299Gly PCR 产物，条带4、5、6为Thr399Ile PCR 产物。

图1 PCR 产物电泳图Fig.1 Electrophoresis of PCR products

2.2 Asp299Gly、Thr399Ile SNP 位点及突变频率统计研究发现，梅毒患者TLR4 基因Asp299Gly片段中（即核苷酸位点2296-2544区域内）共有19个位点存在多态性，但未发现Asp299Gly 特征性突变位点A/G 及Thr399Ile 特征性突变位点C/T。由于实验组中一人发病组与两人均发病组的高突变位点大致相同，无特殊差异性，所以综合统计其重要突变位点及突变频率如下：位点2463 上A 缺失，发生频率为13.8%（11/80）；位点2498 上A 缺失，发生频率为30%（24/80）；位点2503 上A 缺失，突变频率为10%（8/80）；位点2533 上C 突变为A，发生频率为13.8%（11/80）；位点2533 上C 缺失，发生频率为13.8%（11/80）；位点2535 上G 缺失，发生频率为15%（12/80）。梅毒患者TLR4 基因Thr399Ile 片段中（即核苷酸位点2595-3000 区域内）共有22 个位点存在多态性，多为单个碱基突变，高突变位点较少。一人发病组重要突变位点及突变频率如下：位点2990上C突变为A，突变频率为10%（4/40）；位点2992 上G 突变为C，发生频率为10%（4/40）。两人均发病组重要突变位点及突变频率如下（见表2.2.4）：位点2631上C突变为A，发生频率为7.5%（3/40）；位点2633上A缺失，发生频率为10%（4/40）；位点2989 上C 缺失，发生频率为7.5%（3/40）；位点2992上G突变为C，突变频率为7.5%（3/40）。

2.3 Asp299Gly、Thr399Ile 的SNP 位点突变频率在各组中分布情况的统计结果将Asp299Gly、Thr399Ile 突变频率较高位点进行组间两两比较，结果显示：一人患病组Asp299Gly高突变位点2498A缺、2535G 缺失差异有统计学意义（P＜0.05）（表1），两人均发病组Asp299Gly 高突变位点2463A 缺失、2498A 缺失差异有统计学意义（P＜0.05）（表2），而实验组中一人患病组与两人均发病组对比，所有高突变位点频率分布差异均无统计学意义（P＞0.05），故实验组中一人患病组与两人均发病组无特殊差异，对两组中差异有统计学意义位点进行综合统计结果见表3，将结果进行χ2检验，结果显示位点2498A 缺失差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

目前梅毒免疫发病机制尚不明确，研究认为，人体感染梅毒螺旋体后，体内将发生一系列复杂的细胞免疫和体液免疫，而这些免疫反应的类型、强度和持续时间将影响疾病的严重程度、病程及转归，这提示梅毒的遗传易感性可能与某些免疫相关基因存在关联［14-16］。Toll 样受体作为天然免疫中的重要识别受体，在感染性疾病的防御中将会有不可替代的作用，其多态性可能影响疾病的发病，病情以及预后［17-19］。

表1 一人患病组和对照组Asp299Gly 高突变位点分布频率Tab.1 Distribution frequencies of Asp299Gly high mutation sites in one patient and control group

表2 两人均患病组和对照组Asp299Gly 高突变位点分布频率结果Tabl.2 Distribution Frequency of Asp299Gly High Mutation Sites in Patients and Control Groups

表3 病例组综合统计结果Tab.3 Comprehensive statistical results of case group

鉴于人类TLR 基因在机体天然免疫中的重要的功能，其基因变异也倍受关注［20-21］。目前对梅毒与TLRs 受体家族的相关研究的报道相对较少，国内仅发现有学者对梅毒患者与Toll 样受体2 基因单核苷酸多态性研究［18］，并未发现有关于梅毒与TLR4 基因多态性的相关性研究报道。作为TLRs 家族中要的成员，目前发现TLR4 基因在编码区至少存在+896A/G 与+1196C/T 两个特征性单核苷酸多态性位点，即Asp299Gly 和Thr399Ile。研究表明［22-23］，TLR4 作为LPS 的识别受体，其基因第4 外显子Asp299Gly 的突变，可改变TLR4 的细胞外结构，导致对LPS 无反应或LPS 信号通路抑制。因此，本研究探讨TLR4Asp299Gly/Thr399Ile 的多态性与梅毒的关系。

本研究发现，在对照组和实验组中均未检测到Asp299Gly 特征性突变位点A/G 及Thr399Ile 特征性突变位点C/T。梅毒患者TLR4的基因Asp299Gly片段和Thr399Ile 片段突变率增加，Asp299Gly 片段（即核苷酸位点2296-2544 区域内）中共有19 个位点存在多态性，Thr399Ile 片段中（即核苷酸位点2595-3000 区域内）共有22 个位点存在多态性。本研究中Asp299Gly 片段2498 位点突变率较高，差异具有统计学意义（P＜0.05），但目前没有报告表明此位点是梅毒患者TLR4 基因的特征性多态性位点。不足之处是本次试验患者样本量较少，因此有一定局限性。下一步研究方向可以通过增加样本含量进一步做此方面的研究，以期为阐明梅毒易感性和先天性免疫机制提供依据，这对从基因多态性层面，再结合其他方面的数据寻找预防、诊断、治疗梅毒的方法有重要意义。