毛发移植中的毛囊保存液的应用和研究进展

张 舒，蒋 献

（四川大学华西医院 皮肤性病科，四川 成都，610041）

雄激素性秃发(androgenetic alopecia，AGA)是最常见的一种秃发疾病，在我国AGA患者总数超过1亿，其中以 III-IV级秃发最多见[1]，且很难通过单纯药物治疗获得令人满意的效果[2]。1959年Orentreich提出枕部头皮为雄激素非敏感区，这个区域可为毛发重建提供理想的种子[3]。该“优势供区”原则的发现，开启了现代毛发移植的发展。毛发移植技术的出现为脱发患者带来了转机。尽管毛发移植已广泛应用于临床，但近20年来该技术尚未取得突破性进展。受到供区毛囊数量的不足的局限，如今的毛发移植依然难以满足重度秃发或者弥漫性秃发患者的治疗需求[2,4-5]。为了解决毛囊种子不足的问题，毛发再生医学逐渐兴起，尽管近期人工毛囊技术取得了令人惊喜的进展[6]，但距离临床应用还有漫长的路要走[7]。

在毛发移植术中影响毛囊存活率的关键在于毛囊组织离体阶段，而毛囊保存液是离体阶段的重要环节。尽管有大量的研究关注于改善毛发移植手术技巧和探索毛囊生理机制，然而毛囊保存液却往往被忽视。关于毛囊保存液有三个重要的问题：(1) 是否可以找到比生理盐水更好的保存液？哪种方案是最好的?有什么证据支持这种方案？（2）理想的保存液应具备哪些功能？(3)评价的终点是什么？为解决上述问题，我们必须将我们的想法建立在对大量研究回顾的基础上。

1 现有的毛囊保存液方案

在器官移植手术中，可用到的三大类移植物保存液：静脉输注用液体、培养基、低温组织保存液（表1）。

1.1 生理盐水保存液

在先今的植发手术中，大多数医生选择使用生理盐水作为毛囊的保存液（包括磷酸盐缓冲的生理盐水）。若毛囊的“离体”时间短，此时用生理盐水进行简单的水合就足以保护组织。但是随着手术时间的延长，毛囊离体时间在2小时内、24小时、48小时，其移植后存活率分别为95.7%、84%和68%[8]。2-4小时内毛囊存活率不受离体时间影响，但4个小时后存活率开始下降[9]。有证据表明保存液会影响移植物的生存能力，特别是针对小移植物的毛发移植[10]。综上，若毛囊离体时间小于4小时，使用生理盐水是合理的。而对于移植物较小、移植数量较大、毛囊离体时间较长的情况，寻找更佳的保存液保障毛囊存活率则显得更有价值。

1.2 组织培养液/培养基

细胞培养基是为在37°C的专门CO2培养箱中培养细胞和组织而设计的，并不适合用作冷冻保存液。在评价培养基作为毛囊保存液的研究中，结果各不相同。有学者认为与DMEM相比，平衡液中保存的移植物的存活率更高[11]。另一些研究着眼于含有附加成分的培养基，例如：bis(maltolato)oxova-nadium(BMOV)[10]、一氧化氮抑制剂[12]、氨基胍[13]，这些附加成分可能是提高移植物存活率的先决条件。研究发现，与保存在磷酸盐缓冲盐水中的移植物相比，在DMEM中室温保存5小时并加入凋亡抑制剂（如氨基胍）的移植物在随后的组织培养中表现出毛干长度更大及生长因子的上调[13]。小规模的研究已显示了一些益处，尚待更大规模、高质量的对照研究进一步评估。

1.3 低温组织保存液

在生理温度下 (37°C)保存器官可以加速组织ATP的分解，并由于较高的代谢活动而转向厌氧糖酵解。目前临床上减少缺血引起的组织损伤的主要实用技术是降低组织温度——使用冷冻储存溶液。当组织温度从37°C降低到0°C时，新陈代谢所需的能量也相应降低了12倍[14]。在4°C，代谢率是正常生理温度的10%[15]。与常温相比，低温保存的移植物表现出更少的脂质过氧化(自由基损伤)[16]。然而，这种益处可能会被一种称为“冷损伤”的过程所抵消：低温会导致细胞膜ATP Na/K泵的中断，钠离子迅速进入细胞，随后导致细胞水肿。同时，低温可导致细胞内钙的积累，可以激活降解酶[17]。冷损伤可能是导致低温保存的移植物存活率较室温保存无明显差异的原因之一[18]。

在器官移植领域，一些抗“冷损伤”的低温存储溶液被商业开发[例如，Viaspan®(杜邦Phar-maceutical,Wilmington,Delware,USA)，diol®(IMTX Sangstat,Lyon,France)，Celsior®(Methapharm Inc.)]。这些溶液通过维持肿胀压和防止水分进入细胞壁保护细胞免受冷损伤。研究发现，用威斯康星大学肝移植保存液（the University of Wisconsin solution，UW) 保存48小时的各组织存活率明显高于生理盐水组[19]。使用组氨酸色氨酸酮戊二酸酯(HTK)保存液进行器官移植的远期并发症少于UW保存液[20]。一个较新的低温保存液——HypoThermosol-FRS®(BioLife Solutions,Inc.Bothell，美国华盛顿)已被用作头发移植的移植物保存溶液[21]，与生理盐水相比，HypoThermosol-FRS保存的移植物表现出更少的脂质过氧化(自由基损伤)[16]。

表1 不同保存液的基本特征

2 毛囊保存液应具备的功能

2.1 对抗缺血和缺血再灌注损伤

离体组织的携氧动脉血液供应不足，氧的消耗会导致线粒体中电子传递链的崩溃，这对于细胞ATP（adenosine triphosphate）的氧化磷酸化/有氧呼吸非常重要[22]。毛囊中含有快速分裂的上皮细胞，因此需要较高的ATP。在器官移植领域，氧合全氟碳化合物、含氢溶液作为血红蛋白替代物的保存液[23,24]，或直接向组织提供ATP均可有效克服缺血性损伤[25]。在植发领域，使用含ATP的保存液，离体5小时的毛囊表现出更好的组织生存能力，毛干生长速度更快[26]。考虑到ATP通常不能很好地被细胞膜吸收，有学者尝试使用三磷酸腺苷脂质体配方，发现脂质体和ATP均在缺血损伤后维持细胞代谢活性和防止细胞坏死方面发挥作用[27]。

缺血-再灌注损伤（Ischemia-reperfusion injuries，IRI）可导致AMP向ATP转化延迟，ATP的产生下降[28]，也是导致组织损伤和移植物存活率降低的重要临床现象。强自由基清除剂对各种组织IRI具有保护作用[29]。与生理盐水相比，HypoThermosol-FRS保存的毛囊的自由基活性明显降低、Bcl-2表达增加[16,21]。

2.2 调节毛囊的生长周期

一个毛囊平均一生经历10-30个生长周期(Hair cycle,HC)，毛发的生长不是一个连续的过程，毛囊会被周期性更新，HC包括：生长期（anagen）、退行期(catagen)、休止期(telogen)、空毛囊期（部分）(exogen)。HC是毛囊干细胞（hair follicle stem cells,HFSCs）和毛乳头（dermal papilla,DP）共同作用的结果[7,30-33]，并且受到多种生长通路的影响，例如Wnt/β-catenin、骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子(TNF-b)和Notch等信号通路[34-36]。

保存液作用于调节HC已取得一定的临床进展。保存在添加有一氧化氮抑制剂的培养液中的毛囊，持续生长性更好，休止期更不明显[12]。DP和真皮鞘细胞（dermal sheath，DS）作为毛发生长调节剂已获得专利[37]。头皮平滑肌是HC的重要调节靶点[38]，局部外用含有a1雄激素受体拮抗剂可调节头皮血管的平滑肌中氨基酸相关受体受到，同时调节立毛肌的收缩，使头发抗拉扯能力增加400%，减少脱发[39]。齐墩果酸（Oleanolic acid，OA）是一种五环三萜类化合物，OA通过Wnt/β-catenin通路可以在体外模型中刺激毛发基质细胞增殖，促进毛发生长[40]。

近期研究发现淋巴管也参与调节毛发的HC。毛囊由休止期进入生长期前后，周围的毛细淋巴管发生重构，当皮肤下毛细淋巴管凋亡、淋巴引流少，原本处于静止状态的毛囊干细胞开始活动，小鼠全身的毛囊进入生长期[41]。研究证实，淋巴管内皮细胞的条件培养基可促进人真皮乳头细胞的生长[42]。

3）保护毛囊干细胞

HFSCs生态位的维持和干细胞的静止-激活状态的交替血管、淋巴管、脂肪组织或皮肤内的直接细胞-细胞相互作用等因素的影响[43-45]。脂肪细胞前体细胞分泌血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF-a)可激活毛乳头的PDGF，进而激活DP[46]。富含Ancocyanin的黑醋栗萃取物（blackcurrant extract，BCE)可使毛囊干细胞标记物角蛋白19和其他干细胞标志物CD34的表达显著增强[47]。旁分泌因子EGF、TGF-β、IGF -1、HGF和VEGF具有调节细胞迁移增殖、重构细胞外基质(ECM)和促进血管生成的作用[48]，是调节毛发生长的关键旁分泌因子[49]。富含生长因子的富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)与保存液混合后，毛囊再生速度更快，再生毛发更多[50,51]。用含干细胞的培养基培养的HFSCs具有更短的种群倍增时间、更高的存活率和更好的间充质干细胞特性的保存性，用该方法处理的毛囊移植体内后毛囊数量显著增加生长、休眠期毛囊数量明显减少[52]。含脂肪干细胞的HFSCs悬液可激活WNT通路和I型聚集（I型聚集物可表达早期毛囊标志物）[53]。毛囊与人脐血间充质干细胞共培养可提高体外DP的活力并上调Bcl-2、磷酸化Akt和ERK的水平，促进毛发生长[54-55]。

3 问题与展望

毛囊不仅是治疗脱发的关键因素，还可应用于多种学科的再生医学。HFSCs具有高度的可塑性和分化能力，它们可以通过分化成皮肤中的表皮、真皮和部分毛囊来促进皮肤伤口的愈合[56]。此外，研究证实HFSCs还可分化为神经细胞、胶质细胞、角质形成细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和黑色素细胞[57,58]，移植的HFSCs可促进周围神经和脊髓损伤的恢复，并具有心脏再生的潜力[59,60]。考虑到毛囊很容易从每个人身上获得，不易形成肿瘤，HFSCs可以冷冻保存而不丧失分化潜能，可见毛囊具有广阔的发展前景。

基于上述研究成果，毛囊保存液是毛囊再生医学中不容忽视的一个重要环节，它直接或间接的影响着毛囊的存活率。时至今日，大多数外科医生仍然继续使用生理盐水作为毛囊保存液，其他的医师会选择使用乳酸林格氏盐或优化pH为7.4的生理盐水，很少有外科医生使用任何其他保存液方案。尽管初步研究表明一些其他的保存溶液可能会提高移毛囊移植物的存活率和/或有利于毛发再生，然而，这些有限的研究尚存在一些矛盾的结论[61]，尚且缺乏大型的随机对照研究可以指导我们选择保存液。

考虑到现代大多数植发手术的存活率可高达85-90%，未来毛发再生医学的焦点将关注于对HFSCs和HC的调控。HypoThermosol-FRS保存液的出现很好的解决了缺血再灌注和冷损伤的问题，在此基础上，通过优化保存液的成分构成，使保存液具有促进HFSCs增殖分化、延长毛囊生长期、提高移植物血管化等功能将是保存液未来的发展趋势。此外，毛发移植中尚存在一些悬而未决的问题，例如术后急性休止期脱发的机制是什么？可以利用保存液方案解决该问题吗？都有待进一步的研究进行探索，从而克服毛囊体外保存的技术壁垒，促进毛发移植技术的革新。