基于网络药理学的延胡索干预心力衰竭作用机制研究

陈晶　王萌　侯志涛

摘要：目的  采用网络药理学方法探究延胡索干预心力衰竭可能的作用机制。方法  检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、中国天然产物化学成分库，根据口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18、生物半衰期（HL）≥4.00对延胡索可能的生物活性成分进行筛选，并通过蛋白质数据库Uniprot筛选出各活性成分可能存在的靶点，通过CTD、TTD、DrugBank数据库挖掘心力衰竭相关的作用靶点。通过基因注释工具Metascape分析延胡索干预心力衰竭的分子机制。结果  筛选出延胡索生物活性成分26个，预测出延胡索与心力衰竭相关的靶点210个，蛋白质相互作用网络构建筛选出关键靶点37个。Metascape分析顯示，延胡索干预心力衰竭的关键靶点主要与炎症反应、细胞凋亡和调节肠道菌群等生物过程有关。结论  延胡索不仅可直接对心力衰竭起到治疗作用，还可通过抗炎、抑制细胞凋亡及调节肠道菌群间接发挥疗效。

关键词：延胡索;心力衰竭;网络药理学;信号通路;作用机制;肠道菌群

中图分类号：R259.416.1;R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）03-0071-07

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201903319

Study on Mechanism of Intervention of Corydalis Rhizoma in Heart Failure Based on Network Pharmacology

CHEN Jing， WANG Meng， HOU Zhitao

Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China

Abstract： Objective To explore the possible mechanism of intervention of Corydalis Rhizoma in heart failure by using network pharmacology. Methods TCMSP and chemical separation of natural products in China were used. According to oral bioavailability （OB） ≥30%， drug-likeness （DL） ≥0.18， biological half-life （HL） ≥4.00， bioactive components of Corydalis Rhizoma were screened， and the possible targets of each active components were screened out through the protein database Uniprot. Heart failure-related targets were explored through the CTD， TTD， and DrugBank databases. The molecular mechanism of intervention of Corydalis Rhizoma in heart failure was analyzed by the gene annotation tool Metascape. Results Totally 26 bioactive components of Corydalis Rhizoma were screened out， and 210 targets of interventing heart failure were predicted. The PPI network was constructed to screen 37 key targets. Metascape analysis showed that the key targets of Corydalis Rhizoma intervention in heart failure were mainly related to inflammatory response， apoptosis and regulation of intestinal flora and other biological processes. Conclusion Corydalis Rhizoma can not only directly treat heart failure， but also indirectly play roles through anti-inflammation， anti-apoptosis and regulation of intestinal flora.

Keywords： Corydalis Rhizoma; heart failure; network pharmacology; signaling pathway; mechanism; intestinal flora

心力衰竭是一种心脏功能代偿失调综合征，可由各种发展到终末期的心血管疾病引起，其发病机制复杂且发病率高，严重危害人类健康[1-2]。心力衰竭的临床表现以乏力、呼吸困难和体液潴留为主[3]。目前

西医治疗以“金三角”（β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂类药物、醛固酮受体拮抗剂）为指导方案，以神经内分泌抑制剂为主，可在一定程度上改善症状，但效果有限[4]。近年来，中医药治疗心力衰竭取得较好疗效，其中口服药物是主要治疗途径之一。中药治疗具有多方位、多靶点及不易产生耐药性等优势，可提高患者生活质量并有效控制疾病发展，具有较广阔的发展前景。

延胡索为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥块茎，入心、胃、肝、肺、脾经，其味辛、苦，性温，具有活血散瘀、理气止痛功效，主治胸胁、脘腹疼痛，胸痹心痛，经闭痛经等，是临床治疗心力衰竭常用组方药物之一。现代药理研究显示，延胡索具有改善心脏功能的作用[5]，但其作用机制及物质基础目前尚未完全明确，深入研究延胡索干预心力衰竭可能的分子机制对其临床应用具有重要意义。

网络药理学通过数据库检索、分析，采用复杂网络模型，从系统水平解释药物与机体相互作用的关系与机制，其复杂性符合中药多靶点、多成分的特点，是中医药现代研究的新方向。本研究采用网络药理学方法深入挖掘延胡索的主要活性成分及干预心力衰竭可能的作用靶点，阐述其作用机制。

1  资料与方法

1.1  药物活性成分筛选

运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）与中国天然产物化学成分库（http：//pharmdata.ncmi.cn/cnpc/），搜索关键词“延胡索”，获得其活性成分信息。运用TCMSP，根据成分药动学吸收、分布、代谢、排泄（ADME）参数进一步筛选，筛选条件为口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18、生物半衰期（HL）≥4.00[6]。

1.2  药物作用靶点预测与疾病靶点查询

将筛选出的延胡索生物活性成分对应的靶点通过Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）UniprotKB检索功能对各靶点人类基因简称进行查询，获得延胡索可能存在的靶蛋白。使用CTD（http：//ctdbase.org/ about/）、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）数据库，以“heart failure”为关键词进行查询，获得心力衰竭疾病过程中已知的靶蛋白。

1.3  成分-靶点网络构建

通过Venny图（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/ venny/index.html）将延胡索活性成分靶点与心力衰竭疾病靶点取交集，得到延胡索与心力衰竭相关的靶点。使用Cytoscape3.7.1构建成分-靶点网络图。

1.4  蛋白质相互作用网络构建

将取交集后的靶点导入在线系统String11.0（http：//string-db.org/），获得蛋白质相互作用（PPI）网络。该系统对每个参与作用的蛋白进行打分，分值越高表明相互作用关系越密切。本研究设置分值>0.9，以保证数据的可靠性。

1.5  生物通路分析

使用基因注释工具Metascape（http：//metascape.org）对PPI网络中的关键靶点进行生物通路富集分析，分析延胡索干预心力衰竭主要参与的生物通路，探讨延胡索干预心力衰竭可能的作用机制。

2  结果

2.1  延胡索活性成分及相应靶蛋白

初步检索得到已知的延胡索活性成分77个，其中符合OB、DL和HL筛选条件的生物活性成分共26个，以生物碱居多，见表1。

表1  延胡索生物活性成分

2.2  药物靶点预测

对26个生物活性成分进行靶点预测，共获得592个靶蛋白，其中包含1个粪肠球菌（gyrb）。运用Metascape对592个靶蛋白的整理结果见图1。其中外侧圆环表示延胡索26个活性成分;内侧圆环中的浅黄色表示该活性成分特有靶点，深黄色表示与其他成分共有的靶点;紫色线连接活性成分间共同靶点，蓝色线提示成分与成分间存在的相互作用关系。删除重复靶点后剩余靶点212个。

图1  延胡索活性成分靶点环形图

2.3  疾病靶点与成分-靶点网络

查询CTD、TTD、DrugBank共得到心力衰竭相关靶点31 397个。通过Venny图取交集得到延胡索中参与心力衰竭的靶点210个。利用Cytoscape3.7.1绘制的延胡索干预心力衰竭成分-靶点网络图见图2。该网络图包括236个节点，其中活性成分节点26个、靶蛋白节點210个。成分靶点间共存在590条相互作用关系。分析发现延胡索中最主要的前8种活性成分为：槲皮素（度=151），牡丹草碱（度=35），四氢小檗碱（度=31），豆甾醇（度=31），隐品碱（度=28），表木栓醇（度=28），延胡索碱（度=28），毕枯枯林（度=27）。

分析靶点节点信息可以发现，与5个以上活性成分存在关系的靶点有27个（见表2），分别为PTGS2、PTGS1、SCN5A、KCNH2、F10、CAM、CHRM3、ADRA1B、CHRM5、ADRB2、CHRM1、OPRD1、OPRM1、RXRA、PRKACA、ADRA1D、HSP90AB1、TOP2B、CHRM4、NCOA2、HTR2A、AR、NOS3、PRSS1、DRD1、HTR3A、F7。其中，PTGS2、PTGS1、SCN5A、KCNH2、F10、ADRB2、RXRA不仅度相对较高，介数中心性也较大，提示这些靶点在延胡索干预心力衰竭的机制中发挥重要作用。

注：红色代表活性成分，绿色代表共有靶点，黄色代表特有靶点

图2  延胡索干预心力衰竭活性成分-靶点网络

表2  延胡索干预心力衰竭潜在靶点信息

2.4  蛋白质相互作用网络构建

延胡索干预心力衰竭的PPI网络见图3。使用Cytoscape3.7.1软件进行整理分析，可更清楚地反映延胡索干预心力衰竭的作用机制。该网络图中包含163个表示靶蛋白的节点与716条表示相互作用关系的线。节点大小与度的大小呈正相关，节点越大表示度越大;线的粗细与关联程度呈正相关，关联越密切线越粗。进一步分析发现，度>均值（8.78）且介数中心性>均值（0.013）的关键靶蛋白有37个，靶蛋白MAPK1的度和介数中心性均最大，表明MAPK1在整个网络中作用较大。

2.5  生物通路富集分析

将延胡索干预心力衰竭的PPI网络筛选出的37个重要靶点进行富集分析，获得重要靶点参与的生物过程及通路（见图4、图5）。图4、图5B中，富集程度用颜色深浅表示，颜色越深表明富集程度越好。图5A中不同颜色节点表示不同通路。可以看出，延胡索干预心力衰竭的关键靶点主要参与癌症通路、AGE-RAGE信号通路、PI3K-AKT信号通路、细胞凋亡。此外还有已知的常见通路，如MAPK、TGF-β等信号通路，进一步说明延胡索干预心力衰竭存在复杂的机制和过程。

3  讨论

心力衰竭属中医学“心水”“心悸”“心痹”等范畴，其中医证型分类尚无统一标准，目前被广泛认可的证型大致包括心阳虚脱、肺肾两虚、气虚血瘀、阳虚水泛等，其中以气虚血瘀证的认可度最高[8]。气帅血行，气虚则不能推动血液正常运行，血行不畅，瘀血阻滞于心脉，心不能正常发挥其生理功能。心为五脏六腑之大主，故瘀阻心脉可出现各脏腑经络病变，临床表现为咳嗽、胸闷气短、四肢水肿、脉结代等。此外，心力衰竭与多种心血管疾病关系密切，且可由多种心血管疾病加重所致，如心肌缺血、冠心病、心律不齐等。目前对心力衰竭的治疗以活血补气药为主。

临床应用活血补气类中药治疗心力衰竭具有较好疗效。张伯礼主张用益气活血法治疗心力衰竭，方用八珍汤加减配伍延胡索、郁金、桑枝、葛根等，八珍汤补益气血以养心，配以延胡索、郁金理气活血、化瘀止痛，桑枝祛瘀通络，葛根调畅气机，该法可使患者左室射血分数明显上升[9]。马晓昌主张以生脉饮为基础方配伍延胡索等治疗心力衰竭气阴两伤证，患者胸闷喘憋、心悸、气阴两虚症状明显好转[10]。翁维良以龙胆泻肝汤加延胡索等治疗肝火上炎型胸痹，其中龙胆泻肝汤可泻肝胆实火，延胡索可发挥活血行气化瘀之功，治疗后患者心绞痛发作次数明显减少，睡眠质量提高，大便恢复正常，精神状态好转[11]。可见，在治疗心力衰竭的多种复方中均包含延胡索，说明延胡索临床用于治疗心力衰竭具有较为重要的意义。

延胡索主要化学成分为生物碱、甾体、有机酸、糖类[12]。现代药理研究表明，延胡索可有效治疗疼痛、高血压，还能扩张冠状动脉，增加血液流通，保护大鼠心功能，缓解大鼠心力衰竭[5，13]。本研究通过TCMSP初步筛选得到延胡索生物活性成分77个，根据ADME参数进一步筛选，得到26个活性成分，挖掘出212个可能存在的靶点，与已知的31 397个心力衰竭相关靶点取交集，最终获得延胡索干预心力衰竭的210个靶点，590个可能存在的关系。本研究表明，延胡索的关键作用靶点包括MAPK1、PTGS2、PTGS1、SCN5A、KCNH2等，重要靶点与多个化学成分存在关系。其中SCN5A已被证实与心律不齐及心肌病有密切联系，可影响治疗心律不齐药物的敏感程度[14]。有研究表明，SCN5A突变可增加心力衰竭的患病率[15]。KCNH2的表达可影响心室肌细胞Kr和Ks重构，从而导致心力衰竭[16]。PTGS2作为前列腺素合成的关键酶，对炎症反应与细胞凋亡起抑制作用，从而与心力衰竭发生关联[17]。值得注意的是，我们在对延胡索活性成分对应的靶点分析过程中发现，粪肠球菌gyrb是延胡索的有效作用靶点之一，而粪肠球菌gyrb是人体肠道内最重要的菌群之一，可产生有利于机体健康的抗生素，并可调节肠道微环境[18]。通过对肠道内菌群的改善实现对心力衰竭的治疗，可能是延胡索发挥抗心力衰竭作用的又一有效机制，目前尚未发现相关文献报道，因此开展延胡索或含延胡索的复方制剂通过肠道菌群调控心力衰竭的研究具有重要的理论和现实意义，有望为心力衰竭的治疗提供新的途径。

延胡索各活性成分间存在着密切的协同关系，其主要的靶点也在心力衰竭中发挥着至关重要的作用。为进一步对延胡索干预心力衰竭的作用机制进行分析，将二者关系进行PPI网络构建与生物通路富集分析，发现PI3K-Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、IL-17信号通路是网络中的关键靶点主要富集的信号通路。PI3K是胞内磷脂酞肌醇激酶的一种，可参与多种生命活动发挥关键作用。Akt作为PI3K下游的信号分子，可参与下游底物的活化。研究表明，PI3K-Akt信号通路主要与细胞生长和凋亡密切相关，可通过影响下游多种效应分子的活化状态在心力衰竭中抑制心肌细胞凋亡，通过对心脏收缩和舒张功能的改善而发挥治疗作用[19]。PI3K-Akt信号通路可通过减少mPTP释放，在线粒体水平上发挥心肌保护作用，从而达到治疗心力衰竭的目的[20]。此外，PI3K-Akt信号通路可令其内源性因子GSK3β磷酸化失活，从而使心肌重构[20]。晚期糖基化终末产物（AGEs）作为细胞表面分子的免疫球蛋白RAGE的重要配体，可诱导巨噬细胞释放白细胞介素（IL）-1β和肿瘤坏死因子-α参与免疫炎性反应。炎症因子在心力衰竭的发生中发挥着重要作用，可抑制心肌收缩并控制心输出量，炎症因子含量是判断心力衰竭严重程度的指标。此外，AGEs在人体内的含量也会影响心衰，AGEs含量增多可加重心肌僵硬程度[21]。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）作为生物体内最典型的低氧反应信号通路，在体内缺氧情况下及时启动一系列生物反应，提高氧分水平。HIF-1α对心肌细胞起到重要的保护作用，HIF-1α含量增加可促進心肌细胞存活和血管生成[22-23]。HIF-1α可诱导PPARγ基因启动子表达参与心肌能量代谢。作为重要的促炎症因子的IL-17，由激活的CD4+T淋巴细胞表达，其表达水平与心肌损害程度呈正相关。研究表明，IL-17广泛参与心力衰竭的发展过程，可能与IL-17参与体内炎性反应与免疫应激反应有关[24]。

本研究表明，延胡索干预心力衰竭的机制存在复杂性与多样性，通过复杂网络中可提炼出多种治疗方案。故在治疗心力衰竭时应“因人制宜”，确定适合的通路与主要相关靶点，针对性的治疗可显著提高疗效，符合中医辨证论治的指导思想。中医药治疗具有多方面、多靶点的优势，不仅在主要通路与靶点上发挥作用，还可与其他次要靶点协同发挥疗效，是方剂“君、臣、佐、使”配伍原则的另一种表现形式。但临床治疗心力衰竭多用复方，本研究仅针对延胡索单味中药展开研究存在一定的局限性，后续将侧重药对及复方的配伍机制研究，进一步揭示中药治疗疾病多成分、多靶点、作用方式多样的机制特点。

综上所述，本研究通过网络药理学研究方法，对延胡索干预心力衰竭复杂机制进行研究，发现延胡索发挥作用的主要生物活性成分包括黄连素、黄连碱、隐品碱等生物碱类。各成分不仅可对心力衰竭起到直接治疗作用，还可通过抗炎、抑制细胞凋亡以及调节肠道内菌群间接起效。总之，本研究建立的延胡索成分-靶点-通路复杂网络可为延胡索干预心力衰竭作用机制提供理论基础，为进一步实验研究提供方向。

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（收稿日期：2019-03-25）

（修回日期：2019-04-18;编辑：陈静）