姜黄素抵抗脓毒症心肌损伤新机制探究

曹星，吴岩，冯建宇，金振晓，马继鹏，翟蒙恩，曹磊

脓毒症是微生物感染引起的系统性宿主反应，其特征在于全身炎症状态（称为全身炎症反应综合征）和多种器官功能障碍［1］。心脏是易受脓毒症损伤的靶器官之一，充分证据显示脓毒症可以导致心脏功能障碍［2］。据报道，脓毒症患者并发心脏功能障碍死亡率高达70%～90%，而无心脏功能障碍的脓毒症患者死亡率为约20%［3］。因此，寻找有效策略保护脓毒症患者心脏功能或缓解脓毒症引起的心脏功能障碍是目前临床上急需解决的重大问题。

姜黄素（Curcumin，Cur）是姜黄根茎的主要提取物。近年来研究发现，姜黄素能够有效改善心肌缺血再灌注损伤［4］、心肌梗死［5］、化疗药物多柔比星诱发的心肌细胞损伤［6］等心血管疾病，其心肌保护作用越来越受到重视。此外，姜黄素也可有效改善脓毒症引起的心肌损伤［3］，但其具体分子机制尚未完全阐明。SIRT3是线粒体内最主要的去乙酰化酶。充分证据显示，激活SIRT3信号通路是改善脓毒症引起的多种器官功能障碍的重要策略［7-8］。最新证据显示，姜黄素可以通过激活SIRT3信号通路缓解心肌缺血再灌注损伤［9］以及慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌线粒体损伤［10］。然而，SIRT3是否介导姜黄素抗脓毒症心肌损伤作用尚不清楚。本研究旨在观察姜黄素对脓毒症小鼠心脏功能、氧化应激和凋亡的影响，并阐明SIRT3信号通路是否介导姜黄素心肌保护作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂姜黄素、DAPI（苯基吲哚）染液购自Sigma 公司；末端脱氧核苷酸转移酶dUTP 缺口末端标记（TUNEL）检测试剂盒购自Roche公司；BCA蛋白浓度定量试剂盒购自Pierce公司；SIRT3特异性抑制剂3-TYP 由空军军医大学第一附属医院心外科实验室赠予；活性氧（reactive oxygen species，ROS）产量检测试剂盒购自Invitrogen公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 脓毒症模型构建按照先前文献描述的方法构建小鼠盲肠结扎穿孔（cecal ligation perforation，CLP）模型［11］。简言之，用异氟烷（2%）将小鼠全身麻醉，腹部消毒后行腹部正中切口（约1.5 cm长）。将盲肠分离并小心地从腹部左侧取出后，结扎盲肠中段。然后，用18 G 针头将盲肠穿刺两次，并将盲肠移回腹膜腔。将盲肠重新定位到腹腔后，关闭腹部切口。对于假手术组小鼠，进行相同的外科手术，但没有进行结扎和穿刺。

1.3 实验分组及药物处理将实验小鼠随机分为6

组：假手术（Sham）组；单纯姜黄素预处理（Cur）组；CLP 组；姜黄素预处理+CLP（Cur+CLP）组；3-TYP预处理+姜黄素预处理+CLP（3-TYP+Cur+CLP）组；3-TYP 预处理+CLP（3-TYP+CLP）组。SIRT3抑制剂3-TYP（50 mg／kg）于术前3日每天通过腹腔注射给药，共给药3次。姜黄素（80 mg／kg）于术前3日，每日通过腹腔注射给药，共给药3次。

1.4 心脏功能测定所有超声心动检查均由超声科医师进行且对小鼠实验分组不知情。CLP 术后2 d，使用配备有RMV-707（30 MHz）探头的Vevo 770高分辨率体内成像系统（VisualSonics公司）进行超声检测，随后分析计算左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短轴缩短率（left ventricular ejection fraction shortening，LVFS）。具体操作方法如以往文献所述［12］。

1.5 心肌凋亡率检测将石蜡包埋的心脏切片用二甲苯脱蜡，然后用不同浓度的乙醇脱蜡。通过TUNEL 染色测定用于原位细胞凋亡检测，具体操作流程参考以往文献方法［13］。用DAPI溶液染色细胞核并用共聚焦显微镜拍照。从每个心脏切片视野内随机取10 个随机图像，并使用Image Pro-Plus软件（NIH）计算心肌细胞凋亡率。凋亡率＝TUNEL 阳性细胞核／所有细胞核×100%。

1.6 心脏ROS产量和MDA含量测定将液氮冰冻的新鲜心脏组织通过冰冻切片机切成10μm厚的冰冻切片，将心脏切片在37℃下与二氢乙锭（DHE，2μmol，Invitrogen公司）一起温育1 h，评估ROS产量，具体实验操作步骤参考以往文献［13］。用激光共聚焦扫描显微镜（Olympus公司）进行扫描心肌组织超氧化物阴离子荧光探针（dihydroethidium，DHE）染色并拍照，用Image Pro-Plus软件计算心肌ROS产量。DHE的激发／发射光谱分别为488和610 nm，检测波长为585 nm。将冰冻心脏组织和生理盐水按照1∶9的比例匀浆后吸取上清液，严格按照MDA试剂盒说明书检测心肌组织内MDA含量。

1.7 凋亡相关蛋白和SIRT3通路蛋白表达测定用含1 mmol 苯甲基磺酰氟（PMSF）（ST505，Beyondtime公司）的RIPA缓冲液（P0013C，Beyondtime公司）裂解心脏组织。将30μg 总蛋白质在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上进行电泳并转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。用TBS-Tween 稀释的5%奶粉封闭1 h 后，用一抗在4℃下探测蛋白质过夜。用TBS-Tween洗涤3次后，将膜与相应的与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1 h，然后用化学发光（ECL）法以检测蛋白质条带并使用Image Lab软件定量分析。实验所用一抗为：抗SIRT3（1∶1 000，Abcam 公司）、Ac-SOD2（1∶500，Abcam公司）、Bcl-2（1∶1 000，CST 公司）、Bax（1∶1 000，CST 公司）、Caspase-3（1∶1 000，CST 公司）和β-actin（1∶1 000，碧云天公司）抗体。

2 结果

2.1 姜黄素预处理激活脓毒症小鼠心肌SIRT3信号通路首先，检测了各组小鼠心肌组织内SIRT3信号通路相关蛋白的表达情况。结果显示，与Sham组小鼠相比，脓毒症小鼠心肌组织内SIRT3的表达量明显降低，而SIRT3下游分子SOD2 的乙酰化水平（Ac-SOD2）明显增高（P＜0.05）。与CLP 组相比，Cur+CLP组小鼠心肌组织SIRT3的表达量明显增高，而Ac-SOD2的表达量明显降低（P＜0.05）。与Sham组相比，Cur 组小鼠SIRT3的表达量无明显区别（P＞0.05）。为了进一步明确SIRT3信号通路是否介导姜黄素预处理的心肌保护作用，笔者通过SIRT3特异性活性抑制剂3-TYP 阻断SIRT3信号通路。如以往文献报道［13］，3-TYP 处理对于SIRT3的表达情况无明显影响（P＞0.05），但SIRT3的活性明显减弱，表现为SIRT3靶蛋白SOD2 的乙酰化水平明显增高（P＜0.05，见图1）。

2.2 姜黄素预处理改善脓毒症小鼠心脏功能，降低血清内LDH含量与Sham组小鼠相比，单纯给予姜黄素预处理对于LVEF、LVFS以及血清内LDH含量均无明显影响（P＞0.05）。与Sham组小鼠相比，CLP 术后2 d小鼠LVEF 和LVFS均明显降低，而血清LDH水平明显增高（P＜0.05）。而与CLP 组小鼠相比，Cur+CLP 组小鼠LVEF 和LVFS均明显增高，而血清LDH水平明显降低（P＜0.05）。与Cur+CLP 组小鼠相比，3-TYP+Cur+CLP 组小鼠LVEF和LVFS均明显降低，而血清LDH水平明显增高（P＜0.05）。3-TYP +CLP 组 与CLP 组 小 鼠 相 比，LVEF、LVFS以及血清LDH均无 明显 差异（P＞0.05，见图2）。

图1姜黄素和3-TYP 预处理对脓毒症小鼠心肌组织SIRT3信号通路的影响

图2姜黄素和3-TYP 预处理对脓毒症小鼠心脏功能和血清LDH含量的影响

2.3 姜黄素预处理抑制脓毒症小鼠心肌内ROS产量，降低脂质过氧化产物MDA含量CLP 术后2 d通过心肌组织冰冻切片DHE染色检测各组小鼠心肌组织内ROS的产量，通过ELISA法检测心肌组织过氧化产物MDA含量。与Sham组小鼠相比，单纯给予姜黄素预处理不影响心肌组织ROS产量和MDA含量（P＞0.05）。而与CLP 组小鼠相比，Cur+CLP 组小鼠心肌组织ROS产量和MDA含量均明显增高（P＜0.05）。与Cur+CLP 组小鼠相比，3-TYP+Cur+CLP 组小鼠心肌组织ROS产量和MDA含量均明显降低（P＜0.05）。3-TYP+CLP 组与CLP 组小鼠相比，心肌组织ROS产量和MDA含量均无明显差异（P＞0.05，见图3）。

2.4 姜黄素预处理降低脓毒症小鼠凋亡率、Bax 和Caspase 3表达量，提高Bcl-2表达CLP 术后2 d

通过TUNEL 染色法检测各组小鼠心肌凋亡情况，通过Western Blotting 检测心肌组织Bax、Bcl-2和Caspase 3表达情况。与Sham组小鼠相比，单纯给予姜黄素预处理对于心肌凋亡率、Bax、Bcl-2和Caspase 3表达量均无明显影响（P＞0.05）。与Sham 组小鼠相比，CLP 术后2 d 小鼠心肌Bcl-2 表达量明显降低，而心肌凋亡率、Bax 和Caspase 3表达量明显增高（P＜0.05）。而与CLP 组小鼠相比，Cur+CLP 组小鼠心肌Bcl-2表达量明显增高，而心肌凋亡率、Bax 和Caspase 3表达量明显降低（P＜0.05）。与Cur+CLP 组小鼠相比，3-TYP+Cur+CLP组小鼠心肌Bcl-2表达量明显降低，而心肌凋亡率、Bax 和Caspase 3表达量明显增高（P＜0.05）。3-TYP+CLP 组与CLP 组小鼠相比，心肌凋亡率、Bax、Bcl-2和Caspase 3表达量均无明显差异（P＞0.05，见图4）。

3 讨论

严重的脓毒症和感染性休克是全世界范围的重要医疗问题之一，而脓毒症诱导的心功能障碍是导致脓毒症患者预后不良甚至死亡的主要原因［14］。有研究证实，脓毒症患者的心脏功能障碍发生率超过40%，伴随心脏功能障碍的脓毒症患者死亡率高达70%［15］。因此，寻找有效药物预防和缓解脓毒症诱发的心脏功能障碍对于提高脓毒症患者的生存率，改善生活质量有非常重要的临床意义。近年来研究发现，姜黄素可明显减轻心肌缺血再灌注损伤［4］、心肌梗死［5］、化疗药物多柔比星诱发的心肌细胞损伤［6］、异丙肾上腺素引起的缺血性心肌损伤［16］、心肌肥厚［17］等心血管疾病。此外，姜黄素也可改善不同因素诱发的脓毒症心肌损伤。Yang等［3］研究发现，姜黄素处理可显著降低盲肠结扎穿孔诱导的脓毒症大鼠血浆中肌钙蛋白I和MDA水平，增加盲肠结扎穿孔后心肌SOD水平，增强心肌收缩力，减轻心肌炎症和结构损伤。Wang 等［18］证实，姜黄素可以通过抑制白介素（interleukin，IL）-6、肿瘤坏死因子和IL-1β炎性因子的表达，抑制心肌炎症反应，改善脂多糖诱导的心肌损害。与以往研究相一致的是，本实验同样证实，姜黄素预处理可以有效改善脓毒症引起的心脏功能损害，降低ROS产量和MDA 含量，降低心肌细胞凋亡率，抑制促凋亡分子Bax 和凋亡执行分子Caspase 3的表达，促进抗凋亡分子Bcl-2的表达。特别值得注意的是，姜黄素心肌保护作用的发挥伴随SIRT3信号通路的激活。

图3姜黄素和3-TYP 预处理对脓毒症小鼠心脏氧化应激的影响

图4姜黄素和3-TYP 预处理对脓毒症小鼠心肌凋亡的影响

SIRT3是线粒体内最主要的去乙酰化酶，其活性与Sirtuin 家族其他成员一样依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）［13］。SIRT3可通过去乙酰化修饰多种靶蛋白参与调节机体氧化应激状态，保护组织细胞免受氧化应激损伤。SOD2是位于线粒体中一种重要的抗氧化酶，也是SIRT3在抗氧化应激作用中研究最多的靶蛋白之一［19］。SIRT3主要通过去乙酰化修饰SOD2，从而增加SOD2 清除ROS的能力［20］。充分证据表明，上调SIRT3的表达或活性是改善氧化应激诱导的组织损伤的有效策略。例如，白藜芦醇可通过上调SIRT3表达减少H2O2诱导的H9c2细胞凋亡和ROS产量［21］。褪黑素通过增强SIRT3活性抑制氧化应激损伤，从而改善衰老诱导的生育能力下降［22］。阿卡地新（AMPK 激动剂）或乙酰基-1-肉碱（一种抗氧化剂）治疗通过恢复SIRT3的表达和活性，抑制线粒体氧化应激损伤，最终减轻顺铂诱导的急性肾损伤［23］。此外，SIRT3也是调节细胞凋亡的关键分子。SIRT3过表达可激活NF-κB，增加Bcl-2／Bax比，并保护H9c2细胞免受H2O2诱导的细胞凋亡［21］。SIRT3可以直接结合和去乙酰化Ku70，促进Ku70与促凋亡蛋白Bax 相互作用，阻碍Bax 易位至线粒体并最终发挥抗细胞凋亡作用［24］。值得注意的是，提高SIRT3的表达和活性已被证实能有效缓解脓毒症引起的其他器官损伤。Xu等［8］发现，白藜芦醇可通过激活SIRT3／SOD2信号通路改善脓毒症引起的急性肾损伤。Sun等［7］发现，增加SIRT3表达可通过去乙酰化CypD，减轻认知障碍和神经细胞凋亡，保护线粒体膜的完整性，从而缓解脓毒症脑病诱导的学习和记忆功能障碍。在本研究中，笔者发现，脓毒症小鼠与假手术组小鼠相比，心肌组织内SIRT3的表达明显降低，伴随SIRT3下游分子SOD2的乙酰化水平明显提高。以上结果强烈提示，SIRT3信号通路受损可能是脓毒症诱导心肌损伤的潜在机制，而激活SIRT3信号通路可能是缓解脓毒症心肌损伤的新策略。

近年来，越来越多的研究显示，姜黄素具有强效抗氧化应激损伤和抗细胞凋亡作用。姜黄素可减轻心肌缺血再灌注［25］、多柔比星心脏毒性［6］、机械创伤［26］等疾病状态下心肌氧化应激损伤和心肌凋亡。在本研究中发现，脓毒症小鼠心肌组织内ROS产量和脂质过氧化产物MDA含量明显增加，而姜黄素预处理可以明显降低心肌ROS产量和MDA含量，即姜黄素预处理能够有效抑制脓毒症引起的心肌氧化应激损伤。此外，脓毒症小鼠心肌组织凋亡率明显增加，伴随心肌促凋亡蛋白Bax和凋亡执行蛋白Caspase 3的表达量明显增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显降低。姜黄素预处理可以明显降低凋亡率、Bax 和Caspase 3的表达量，提高Bcl-2 的表达水平，即姜黄素预处理能明显缓解脓毒症引起的心肌细胞凋亡。如前所述，SIRT3具有抗氧化应激损伤和细胞凋亡生物活性。姜黄素预处理可以明显激活SIRT3信号通路，而抑制SIRT3信号通路后，姜黄素缓解脓毒症心脏功能障碍、氧化应激损伤和心肌细胞凋亡的作用均明显减弱。综上，姜黄素抗脓毒症心肌损伤的作用主要由SIRT3信号通路介导。

综上所述，本研究发现姜黄素预处理可通过抑制氧化应激损伤和心肌细胞凋亡抑制脓毒症引起的心肌损害，且上述保护作用主要由SIRT3信号介导。本研究为临床上应用姜黄素治疗脓毒症心肌病提供了新的实验依据。