RhoA和ROCK1蛋白在结肠癌组织中的表达及临床意义

郭叶青 王晓艳

(1.三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 呼吸与危重症医学科，湖北 宜昌 443003；2.中南大学 湘雅三医院 消化内科，湖南 长沙 410013)

结肠癌是临床上最常见的消化道恶性肿瘤之一，早期结肠癌患者预后尚可，晚期患者治疗效果与预后极差[1]。如何准确地判断结肠癌患者的预后，并及时采取相应的治疗是当前研究的热点。Rho即Ras类似物，主要有Rho(RhoA、RhoB、RhoC)、Rac(Rac1、Rac2、Rac3)和Cdc42三个亚家族，是一类小G蛋白，在细胞信号转导方面起着重要的作用[2]。RhoA为Rho蛋白中最常见的一种，其下游效应分子包括Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated curl-forming protein kinases，ROCK1)、蛋白激酶A(protein kinase A，PAK)、蛋白激酶N(protein kinase N，PKN)、磷脂酰肌醇-3-羟激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K)等，这些分子介导了RhoA的作用[3]。研究表明，RhoA和ROCK1蛋白在多种恶性肿瘤中的表达水平均升高，在促进肿瘤侵袭转移过程中具有重要意义，对肿瘤患者的预后影响较大[4-6]。目前有关RhoA和ROCK1蛋白在结肠癌发生发展过程中的作用，鲜有报道。本文运用免疫组化方法，检测结肠癌组织芯片中RhoA和ROCK1蛋白表达，分析其与结肠癌临床病理特征间的关系，并进行生存分析，探讨RhoA和ROCK1蛋白与结肠癌生物学行为的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织芯片

本研究所用的2张组织芯片购自上海芯超公司，芯片的编号是OD-CT-DgCo101-102。每张组织芯片上含75例结肠癌患者的结肠癌组织及癌旁的正常黏膜各1点，共150点，75例患者均在2012年1月～2013年1月行手术治疗。所有患者均具备完整随访资料，以最后一次的随访日期或者患者死亡的日期为随访结束点，随访的时间以月算，随访截止日期为2018年10月。以手术的日期到随访结束的日期或患者死亡的日期为生存期，最短的随访时间是1个月，最长的随访日期是66个月。组织芯片上每块组织直径1.5 mm，厚4 μm，其中男性38例，女性37例；年龄分布为30～82岁，>60岁患者49例，<60岁患者26例；所有患者术前均未接受放化疗，其中Dukes A期12例，Dukes B期23例，Dukes C期31例，DukesD期9例；高分化10例，中分化53例，低分化12例；合并淋巴结转移37例，无淋巴结转移38例；标本均通过HE染色验证。

1.1.2 主要试剂

鼠抗人单克隆抗体RhoA购于美国Sigma公司，鼠抗人单克隆抗体ROCK1购于美国Santa Cruz公司，DAB显色试剂盒、即用型免疫组化试剂盒购于福州迈新公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化方法

结肠癌组织芯片经烤片、脱蜡、水化、抗原修复、PBS液漂洗之后，以3%过氧化氢孵育；PBS液漂洗后滴加非免疫动物血清封闭，室温孵育；PBS冲洗后滴加1∶200 RhoA和1∶10 ROCK1抗体，4℃过夜；PBS液漂洗后滴加二抗，室温30 min；PBS液漂洗、DAB试剂显色、苏木精进行复染，再行脱水、透明、封片。用已知的阳性染色结肠癌组织切片作阳性对照，用PBS液替代一抗为阴性对照，显微镜下拍照。

1.2.2 免疫组化评判标准及观察评分

根据目的蛋白表达阳性的细胞比例及染色强度评分。阳性细胞计数<5%，记0分；阳性细胞计数5%～25%，记1分；阳性细胞计数26%～50%，记2分；阳性细胞计数51%～75%，记3分；阳性细胞计数>75%，记4分。阴性染色，为0分；淡黄色染色，为1分；棕黄色染色，为2分；呈棕褐色染色，为3分。由两位病理专家分别根据上述阳性细胞比例和染色进行评分，两项相加后记为最终评分。结果的评判：0分为阴性表达(-)；1～2分为弱阳性表达(+)；3～5分为中等阳性表达(++)；6～7分为强阳性表达(+++)。

1.2.3 临床病理特征和生存分析

分别分析RhoA蛋白和ROCK1蛋白的表达与结肠癌临床病理特征之间的关系，并进行生存分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。各组间率的比较通过卡方检验或者Fisher确切概率法，相关性分析采用Spearman相关性分析，生存分析方法采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RhoA蛋白在结肠癌及癌旁组织中的表达及与结肠癌临床病理特征的关系

由于脱片原因，本实验分析了69例结肠癌组织及67例癌旁正常粘膜组织中RhoA蛋白的表达。结果显示，结肠癌组织及癌旁正常粘膜组织中RhoA蛋白表达定位在胞浆、胞膜，阳性的染色呈棕黄色或者棕褐色(图1A～1D)。RhoA蛋白在结肠癌组织的表达阳性率达68.12%，而癌旁正常黏膜组织是44.78%，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。进一步分析RhoA蛋白的表达与结肠癌患者各项临床病理特征间的关系，发现RhoA蛋白的表达与结肠癌有无淋巴结转移、临床分期明显相关(均P<0.05)，而与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度等无明显相关(均P>0.05)，见表2。

表1 RhoA蛋白在结肠癌及癌旁正常粘膜组织中的表达

注：两组阳性率比较，χ2=7.54,P<0.01

表2 RhoA蛋白表达与结肠癌临床病理特征的关系

2.2 RhoA蛋白表达对结肠癌患者术后生存时间的影响

Kaplan-Meier生存分析结果示，RhoA阳性表达组的术后生存时间为41.78±4.26月，患者的5年生存率为42.70%；而RhoA阴性表达组的术后生存时间为54.59±2.78月，患者的5年生存率为59.61%，差异有统计学意义(χ2=5.76，P<0.05)，见图2。

2.3 ROCK1蛋白在结肠癌和癌旁正常粘膜中的表达及与结肠癌临床病理特征的关系

由于脱片原因，本实验分析了69例结肠癌组织及64例癌旁正常粘膜组织中ROCK1蛋白的表达。结果显示，结肠癌组织及癌旁正常粘膜组织中ROCK1蛋白表达定位在胞浆，阳性染色呈棕黄色或者棕褐色(图3A～3D)。结肠癌组织ROCK1蛋白表达的阳性率达69.57%，而癌旁正常黏膜组织中ROCK1蛋白表达的阳性率是42.19%，差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。进一步分析ROCK1蛋白表达与结肠癌患者各项临床病理特征间的关系，结果显示ROCK1蛋白的表达与结肠癌有无淋巴结转移和临床分期明显相关(均P<0.05)；而与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度等无明显相关(均P>0.05)，见表4。

表3 ROCK1蛋白在结肠癌及癌旁正常粘膜组织中的表达

注：两组阳性率比较，χ2=10.12，P<0.01

表4 ROCK1蛋白表达与结肠癌患者临床病理特征的关系

2.4 ROCK1蛋白表达对结肠癌患者术后生存时间的影响

Kaplan-Meier生存分析结果示，ROCK1阳性表达组的术后生存时间为36.33±4.13月，患者的5年生存率为38.10%；而ROCK1阴性表达组的术后生存时间为50.13±3.71月，患者的5年生存率为59.60%。两组间的生存率经Log-rank检验，差异有统计学意义(χ2=11.81，P<0.01)，见图4。

2.5 结肠癌组织中RhoA蛋白与ROCK1蛋白表达的相关性分析

在47例RhoA蛋白表达阳性结肠癌组织中，40例ROCK1蛋白表达阳性；22例RhoA蛋白表达阴性组织中，14例ROCK1蛋白表达阴性。Spearman等级相关分析结果显示，RhoA蛋白与ROCK1蛋白在结肠癌组织中的表达呈正相关(r=0.60，P<0.05)，见表5。

表5 结肠癌组织中RhoA蛋白与ROCK1蛋白表达的关系

3 讨论

Rho蛋白家族是一类小G蛋白，RhoA具备GTP酶的活性，并具有与GTP结合的活化态及与GDP结合的非活化态这两种构像，通过在这两种活性状态间的转换，使RhoA蛋白扮演着类似“分子开关”的角色[7]。目前的研究已证实，RhoA下游的效应分子包括ROCK1、PAK、PI3K、PKN等。ROCK1是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，ROCK1蛋白的一级结构自氮末端依次具备激酶催化的结构域、与Rho蛋白结合的结构区及碳末端的Pleckstrin同源区，ROCK1蛋白激活后能够进一步磷酸化下游的靶分子[8]。已有大量研究证实，RhoA/ROCK1信号通路可调节细胞骨架相关蛋白从而促进肿瘤细胞的运动[9]；可调节细胞周期相关蛋白表达从而促进肿瘤增殖[10]；可增强基质金属蛋白酶活性而促进肿瘤转移[11]；可使肿瘤细胞分泌更多血管生成因子从而促进肿瘤血管生成[12]。

已有较多的研究证明，RhoA、ROCK1的高表达能够促进细胞增殖、抵抗凋亡、加速侵袭转移，且其表达的改变与肿瘤的恶性程度、不良预后密切相关。Liu等[13]研究证实，过表达RhoA可促进肺癌细胞系SPCA1的增殖及侵袭转移。Nishizawa等[14]研究发现，RhoA、ROCK1的过表达可导致胃癌细胞抵抗凋亡，并增强胃癌细胞的转移能力。Ghasemi等[15]研究显示，RhoA、ROCK1抑制剂可降低卵巢癌细胞的增殖及侵袭转移能力。周密等[16]研究证实，RhoA可通过肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer 1，DLC1)介导RhoA-ROCK1信号通路活化，促进乳腺癌细胞的侵袭转移。Shokri等[17]研究表明，在乳腺癌中过表达RhoA可促进乳腺癌细胞增殖及侵袭转移，导致不良预后。

目前有关RhoA蛋白及ROCK1蛋白在结肠癌组织中的表达及临床意义的研究鲜有报道。本研究结果显示，RhoA和ROCK1在癌组织中的蛋白表达阳性率明显高于癌旁正常黏膜组织，证实了结肠癌中存在RhoA及ROCK1蛋白的高表达。RhoA及ROCK1蛋白表达与结肠癌患者有无淋巴结转移、临床分期明显相关。相关性分析结果表明，RhoA与ROCK1在结肠癌组织中的蛋白表达呈正相关，说明RhoA及ROCK1可能在结肠癌的发生、发展中发挥重要的作用，可能促进结肠癌的侵袭转移。生存分析结果示，RhoA及ROCK1蛋白阳性表达组的生存率明显低于阴性表达组，说明RhoA及ROCK1的高表达可能预示结肠癌患者的不良预后。随着对RhoA/ROCK1相关信号通路在结肠癌发生发展过程中的研究深入，RhoA蛋白及ROCK1蛋白有可能作为一项新型的肿瘤标志物，在结肠癌的侵袭转移及患者预后判断方面具有一定的临床指导意义。