HPLC法测定冬虫夏草胶囊中腺苷的含量

许多 刘梅 杨波 刘 静 刘子修 司梁宏 陆瑜

摘要 目的：建立院内制剂冬虫夏草胶囊中腺苷含量的测定方法，为提高该制剂的质量标准提供依据。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱为Hibar-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）;流动相为pH值6.5的磷酸盐缓冲液-甲醇（85∶15）;检测波长为260 nm;柱温30 ℃;流速为1.0 mL/min;进样量为10 μL。结果：腺苷在0.032 7～0.163 5 μg范围内，线性关系良好（R2=0.999 4）;加样回收率为99.8%～101.5%;测定3个批次的冬虫夏草胶囊中腺苷的平均含量分别为0.91 mg/粒，0.92 mg/粒，0.93 mg/粒，相对标准偏差（RSD）分别为0.44%、1.15%、2.06%。结论：该方法简便，准确，重现性好，灵敏度高，可作为冬虫夏草胶囊质量控制指标;所测3批冬虫夏草胶囊中腺苷的含量相近，质量可靠，可用于临床治疗。

关键词 冬虫夏草胶囊;腺苷;高效液相色谱法;含量测定;质量评价;质量控制;核苷;腺嘌呤核苷酸

Determination of Adenosine Content in Dongxia Chongcao Capsules by HPLC

XU Duo，LIU Mei，YANG Bo，LIU Jing，LIU Zixiu，SI Lianghong，LU Yu

（Department of Pharmacy，Air Force Hospital of Eastern Theater Command，Nanjing 210002，China）

Abstract Objective：To develop an HPLC method for the determination of adenosine in Dongxia Chongcao Capsules and provide a basis for improving the quality standards of the preparation. Methods：HPLC was used and the analytical column was Hibar-C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）. The mobile phase was phosphate buffer pH6.5-methanol （85∶15）. The detection wavelength was 260 nm. The column temperature was 30 ℃. The flow was 1.0 mL/min. The injection volume is 10 μl. Results：Adenosine had a good linear relationship （R2=0.999 4） in the 0.032 7～0.163 5 μg range，and the sample recovery was 99.8%～101.5%. The average contents of adenosine in 3 batch slices of Chinese caterpillar fungus Capsules was 0.91 mg，0.92 mg，0.93 mg. The relative standard deviations （RSD） were 0.44%，1.15%，and 2.06%，respectively. Conclusion：The contents of adenosine in the 3 batches of Dongxia Chongcao Capsules are analogical. This method is simple，accurate and available for the quality control of Dongxia Chongcao Capsules. The 3 batches of Dongxia Chongcao Capsules have similar adenosine content and reliable quality，which can be used for clinical treatment.

Keywords Dongxia Chongcao Capsules; Adenosine; HPLC; Content determination; Quality evaluation; Quality Control; Nucleoside; Adenine Nucleotide

中圖分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.06.004

冬虫夏草是麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。作为我国特有的名贵药用真菌，其具有补肺益肾、止血化痰的功效。本院院内制剂虫草胶囊采用超微破壁技术，在避免了溶剂提取造成的活性成分的损失的同时，能够最大限度释放冬虫夏草的活性成分，便于机体的吸收利用。研究表明，冬虫夏草的活性成分主要包括：核苷、多糖、蛋白质、甾醇等，其中核苷类化合物是近年国内外研究的热点。核苷类化合物包括：腺苷、虫草素、鸟苷、肌苷等。腺苷是腺嘌呤核苷酸的简称，具有改善心脑血液循环、抑制中枢神经递质释放等活性，已被中华人民共和国药典作为冬虫夏草及其制品的质控指标[1]。因此，本实验采用了中华人民共和国药典的标准测定冬虫夏草胶囊中腺苷的含量，从而控制其质量。

目前针对腺苷含量的常见测定方法有薄层色谱法[2]、高效液相色谱法[3-9]和高效液相-质谱法[10]等。薄层色谱法较简单，但准确度与专属性不如另外2种方法;高效液相-质谱法准确度、精密度、专属性等性能方面优越，但其价格高昂对人员素质要求也较高，不利于方法的普及。高效液相色谱法分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化，有利于该方法在规模化批量检测中的运用。

因此本实验应用高效液相色谱法对不同批次虫草胶囊中腺苷含量进行测定，以期作为虫草胶囊的含量控制方法，完善冬虫夏草胶囊的质量评价。

1 仪器与试药

1.1 仪器 SHIMADZU LC-10AT VP高效液相色谱仪[岛津企业管理（中国）有限公司，日本，型号：LC-10AT];万分级电子分析天平（赛多利斯，德国，型号：CPA225D）;超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，型号：KH-300P）。

1.2 试剂 腺苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号110879-200202，纯度98%）;甲醇（色谱纯，德国默克，批号：10962907829）;磷酸二氢钾（分析纯，南京化学试剂股份有限公司，批号13121612226）;超纯水（密理博，德国默克公司）。

1.3 分析样品 冬虫夏草胶囊（东部战区空军医院制剂室，批次：ZF0912F001，ZF0912F007，ZF0912F013，虫草粉末质量约0.2 g/粒）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Hibar-C18，4.6 mm×150 mm，5 μm，流动相为pH值6.5的磷酸盐缓冲液-甲醇（85∶15），检测波长为260 nm，柱温30 ℃，流速为1.0 mL/min;进样量为10 μL。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取经105 ℃减压干燥至恒重的腺苷对照品10.22 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含腺苷8.176 μg的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取冬虫夏草胶囊装量差异项下的内容物，混匀，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz 40 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL，置5 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 专属性试验 精密吸取腺苷对照品溶液，按2.1项下的色谱条件进行测定。精密量取冬虫夏草胶囊适量，按照2.3供试品溶液的制备项下制备样品溶液，按照2.1项下的色谱条件进行测定，建立各样品的特征图谱。

2.5 线性关系考察 精密量取对照品储备液液适量并稀释至下列浓度：0.82、1.64、3.27、4.91、6.54、8.18 μg/mL，分别精密量取10 μL进样，以峰面积积分值A为纵坐标，进样量C（μg）为横坐标，得回归方程为：A=33 935C+8 538.9，R2=0.999 5，结果表明，腺苷在0.82～8.18 μg/mL范围内呈良好的线性关系。腺苷线性关系考察结果如表1和图1所示。

2.6 中间精密度试验 取按照2.2和2.3项下制备的腺苷样品溶液10 μL，在2.1项色谱条件下，重复进样5次，测定峰面积，计算腺苷浓度的RSD值。腺苷的RSD为1.12%，结果表明腺苷的进样精密度良好。

2.7 供试品溶液稳定性试验 按照2.2和2.3项下操作，制备腺苷供试品溶液，自配制后0，8，16，24 h依次進样10 μL，记录冬虫夏草中腺苷含量的变化，评价腺苷供试品溶液室温放置不同时间的稳定情况。结果腺苷峰面积积分值的RSD为2.06%，说明样品在24 h内稳定。

2.8 重复性试验 按照2.2和2.3项下操作，取同一批冬虫夏草胶囊（批次：ZF0912F007）制备6份样品溶液，按“2.1”项色谱条件下进样，分别测定，记录峰面积，计算腺苷浓度的RSD值。结果腺苷的平均含量为0.91 mg/粒，RSD为1.49%，表明重复性良好。

2.9 回收率试验 按“2.2和2.3”项下操作使用已知浓度的同一批次样品（腺苷含量为4.66 mg/g）配制9份3组样品溶液，各组分别准确加入5 mL腺苷对照品溶液（0.8、1、1.2 μg/mL），使得腺苷对照品的添加量满足样品量的80%、100%、120%。按“2.1”项下方法操作测定腺苷的含量，计算加样回收率。结果腺苷的平均加样回收率为100.691%，RSD为0.638%。

2.10 样品测定结果 3个批次冬虫夏草胶囊，按“2.2和2.3”项下操作，每个批次制备五份供试品，精密吸取供试品溶液10 μL进样，测定峰面积，外标法计算含量，结果见表3、图2。

3 讨论

3.1 考察指标的选择 冬虫夏草胶囊是我院基于中医药理论采用超微破壁技术制成的中药制剂，能够最大限度的释放冬虫夏草中活性物质，冬虫夏草成分复杂，干扰因素多，如核苷、多糖、蛋白质、甾醇等物质都是其主要活性物质，因此建立一个简单可行的含量测定方法来评价冬虫夏草胶囊的质量很有必要。冬虫夏草作为传统名贵中药具有广泛的药用价值，现代药理学研究已经证实了冬虫夏草中由菌丝发酵产生的腺苷具有维持心脏、肝脏及肠道的正常功能、保护血管内皮、提高机体免疫力等多重功效[11-12]，故而本次实验选择活性成分腺苷作为评价冬虫夏草胶囊质量的指标。结果也显示其含量较高，容易检测，无干扰，可作为冬虫夏草胶囊含量测定的指标性成分。

3.2 提取方法的选择 根据预实验结果，发现用乙醇超声提取40 min，虫草胶囊中腺苷提取率已维持稳定。与加热回流提取方法比较，引入的干扰杂质少、简单易行、提取效率高、定量准确、重复性好，回收率相似，适用于腺苷的定量分析。

3.3 色谱条件的选择 以色谱柱Hibar-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），用pH值6.5的磷酸盐缓冲液-甲醇（85∶15）洗脱，检测波长为260 nm测定腺苷的含量。与文献中方法比较，使用150 mm短柱，分析时间缩短，8 min即可完成测定;加入了pH值6.5的磷酸盐缓冲液，使峰形得到改善，解决了前沿与拖尾的问题，峰形更加对称，从而使定量更加准确。