灵芝多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏脂肪沉积及NLRP3炎性小体表达的影响

孙艳辉 张宏波

摘要 目的：探討灵芝多糖对急性肝损伤小鼠肝脏脂肪沉积及NLRP3炎性小体表达的影响。方法：将48只健康KM小鼠随机分为对照组、模型组及实验组，每组16只。模型组及实验组小鼠以慢性酒精喂养联合急性酒精灌胃法构建急性酒精性肝损伤小鼠模型，且实验组建模期间灌胃150 mg/kg灵芝多糖，1次/d。以全自动生化分析仪检测小鼠肝功能及脂代谢指标;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清炎性反应递质水平;苏木精-伊红（HE）染色检测小鼠肝组织病理学形态;油红O染色观察肝脏组织脂肪沉积;蛋白免疫印迹法（WB）检测肝组织NLRP3炎性小体表达。结果：各组小鼠的血清谷丙转氨酶（ALT），血清谷草转氨酶（AST），血清白细胞介素-1β（IL-1β），血清白细胞介素-6（IL-6），肿瘤坏死因子-α（TNF-α），油红O染色评分，肝组织NLRP3炎性小体相对表达量等，模型组与对照组比较，血清AST、ALT、三酰甘油、总胆固醇、游离脂肪酸、IL-1β、IL-6、TNF-α水平，油红O染色评分及肝组织NLRP3炎性小体相对表达量升高，而实验组均较模型组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：灵芝多糖可通过抑制肝脏组织NLRP3炎性小体表达，抑制急性酒精性肝损伤小鼠炎性反应及肝脏脂肪沉积，有效缓解肝组织损伤，恢复其肝功能。

关键词 急性肝损伤;灵芝多糖;脂肪沉积;肝脏保护;NLRP3炎性小体;表达;肝功能;炎性反应递质

Effects of Ganoderma Polysaccharide on Liver Fat Deposits and NLRP3 Inflammatory Corpuscle Expression of Mice with Acute Liver Injury

SUN Yanhui1， ZHANG Hongbo2

（1 The Emergency Department， Beijing Tiantan Hospital， Capital Medical University， Beijing100050， China; 2 Department of Obstetrics and Gynecology， Xiangya Hospital， Central South University， Changsha 410000， China）

Abstract Objective：To explore the effects of ganoderma polysaccharide on liver fat deposits and NLRP3 inflammatory corpuscle expression of mice with acute liver injury.Methods：A total of 48 healthy KM mice were randomly divided into a control group， a model group and a test group， with 16 cases were in each group.Mice in the model group and the test group were constructed an acute alcoholic liver injury mice model combined the chronic alcohol feeding with the acute alcohol lavage method， and mice in the test group were treated by the lavage method of feeding 150 mg/kg-1 ganoderma polysaccharide， once a day.The liver function and the lipid metabolism indexes of mice were detected by an automatic biochemical analyzer; the serum inflammatory factor contents were detected by an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） method; the liver tissue pathology morphology of mice was observed by a hematoxylin and eosin （HE） staining; the liver tissue fat deposits of mice were observed by an oil red O staining; the NLRP3 inflammatory corpuscle expression of mice was detected by an western blot （WB） method.Results：The experimental results showed the relevant expressions of mice in every group including the serum alanine aminotransferase （ALT）， serum glutamic-oxaloacetic transaminase （AST）， serum interleukin-1β （IL-1β）， the serum interleukin-6 （IL-6）， and the tumor necrosis factor-α （TNF-α）， as well as the oil red O staining scores and the liver tissue NLRP3 inflammatory corpuscle were the same.Comparing the model group with the control group， it could be seen that the relevant expressions of the serum AST， ALT， triacylglycerol， total cholesterol， free fatty acids， IL-1β， IL-6， TNF-α， and the oil red O staining scores， and the liver tissue NLRP3 inflammatory corpuscle in the model group increased; compared with the model group， the test group level was lower， and the difference was statistically significant （all P<0.05）.Conclusion：Ganoderma polysaccharide can inhibit liver tissue NLRP3 inflammatory corpuscle protein expression， and the inflammatory response and liver fat deposits of acute alcoholic liver injury mice， so as to relieve the liver tissue damage and to restore the liver function effectively.

Keywords Acute liver injury; Ganoderma polysaccharide; Fat deposits; Liver protection; NLRP3 inflammatory corpuscle; Expression; Liver function; Inflammatory factor

中图分类号：R284;R575文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.06.006

急性酒精性肝损伤发病机制复杂，乙醇及其毒性代谢产物、脂质过氧化、氧化应激、炎性反应等均参与其中[1-3]。灵芝多糖是多孔菌属灵芝的主要活性成分，其药理学作用广泛，周婕等[4]研究报道，灵芝多糖可有效抑制D-氨基半乳糖（D-Gal）所致小鼠急性肝损伤氧化应激反应，具有肝脏保护效应。但目前有关其对急性酒精性肝损伤的保护作用及抗炎机制尚不明确，因此本研究探究灵芝多糖对急性酒精性肝损伤小鼠的肝脏脂肪沉积的影响及肝脏保护作用，并分析其对肝脏组织NLRP3炎性小体表达的影响，初步探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级、健康、雄性KM小鼠48只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，SCXK（京）2016-0011;于室温22～25 ℃，湿度50%～65%，12 h明暗交替环境下饲养约6 d，完全适应新环境后进行实验研究。

1.1.2 药物 灵芝多糖（福州绿谷生物药业技术研究所，生产批号：180713）。

1.1.3 试剂与仪器 白细胞介素-1β（IL-1β）（批号：20160719）、白细胞介素-6（IL-6）（批号：20160803）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（批号：20160722）、酶联免疫吸附实验（ELISA）检测试剂盒（批号：20160616）购于金斯瑞生物科技有限公司;谷草转氨酶（AST）及谷丙转氨酶（ALT）检测试剂盒（艾美捷科技有限公司，批号：20160519）;AU400全自动生化分析仪、CKX41型荧光显微镜（日本Olympus公司）;Gytation3型酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）;YH27020型电泳仪（美国Bio-Rad公司）;Leica QWin图像分析软件（德国Leica公司）等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将48只健康KM小鼠随机分为对照组、模型组及实验组，每组16只。对照组小鼠则正常饲喂;模型组及实验组小鼠以慢性乙醇喂养联合急性酒精灌胃法[5]构建急性酒精性肝损伤小鼠模型。

1.2.2 给药方法 其中模型组小鼠适应性喂养5 d，然后饲喂5%等体积乙醇液体饲料10 d;实验组小鼠则适应性喂养5 d，然后饲喂5%等体积乙醇液体饲料10 d，期间均灌胃150 mg/kg灵芝多糖，1次/d;模型组及实验组小鼠均于第16天以31.5%等体积乙醇灌胃1次，0.2 mL/10 g，灌胃后禁食。

1.2.3 检测指标与方法

血清肝功能[6]、血脂代谢指标[7]及炎性反应递质[8]检测：灌胃后9 h分别采集各组小鼠静脉血5 mL，经3 000 r/min离心10 min分离血清，以全自动生化分析仪检测血清肝功能指标AST及ALT及血清三酰甘油、总胆固醇、游离脂肪酸等脂代谢指标水平;另以酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清炎性反应递质指标：IL-1β、IL-6、TNF-α。以上检测均严格按照相关试剂盒操作说明进行。

苏木精-伊红（HE）染色[9]观察小鼠肝脏组织病理学形态：采血结束后将各组小鼠均以颈椎脱臼法处死，采集其肝脏组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h，常规制备石蜡组织切片，并行HE染色观察肝脏组织病理学形态变化。

油红O染色[10]观察小鼠肝脏脂肪沉积：肝脏组织采集同1.2.3，以最佳切削温度包埋机进行包埋，制备冰冻组织切片，进行油红O染色，并于光学显微镜下观察脂滴在肝脏组织中的分布范围与面积，若肝细胞内脂滴散在分布，稀少则计0分;若肝脏组织中含有脂滴的肝细胞不超过肝脏组织面积的25%则计1分;不超过肝脏组织面积的50%则计2分;不超过肝脏组织面积的75%则计3分;若整个肝脏组织几乎被脂滴占据则计4分。

蛋白免疫印迹（WB）法[11]檢测肝脏组织NLRP3炎性小体表达：肝脏组织采集同1.2.3，迅速置于液氮中保存，经组织裂解液处理，提取组织总蛋白，BCA法进行蛋白定量，取适量进行蛋白免疫印迹染色，以GADPH为内参，经Leica QWin图像分析软件统计NLRP3炎性小体相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肝功能和炎性反应递质比较

模型组小鼠血清AST、ALT、三酰甘油、总胆固醇、游离脂肪酸及IL-1β、IL-6、TNF-α水平均较对照组升高，而实验组较模型组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 小鼠肝脏组织病理学形态

HE染色显示，对照组小鼠肝脏组织肝小叶结构正常，肝细胞索呈放射状排列，且肝细胞未见水肿、坏死等，肝脏组织亦未见炎性细胞浸润;模型组小鼠肝脏组织肝索排列紊乱，肝细胞肿大、肝细胞质疏松并伴有明显的脂肪变性，细胞内可见大小不一的脂滴，部分肝细胞严重坏死，且肝脏组织中炎性细胞浸润现象明显;实验组小鼠肝脏组织上述病理学变化较模型组有明显改善。见图1。

2.3 油红O染色观察肝脏脂肪沉积

油红O染色显示，对照组小鼠肝脏组织未见脂滴聚集;模型组小鼠肝组织可见大量红色脂滴形成，且数量较多;实验组小鼠肝组织红色脂滴较模型组显著减少。见图2。

对照组、模型组及实验组油红O染色评分分别为（0.04±0.01）分、（3.61±0.97）分、（1.46±0.05）分。模型组油红O染色评分较对照组升高，而实验组较模型组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4 小鼠肝脏组织NLRP3炎性小体表达情况比较  对照组、模型组及实验组小鼠肝脏组织NLRP3炎性小体相对表达量分别为（0.21±0.09）、（0.89±0.07）、（0.43±0.06）。模型组肝组织NLRP3炎性小体相对表达量较对照组升高，而实验组较模型组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

3 讨论

急性酒精性肝损伤是由于过量饮酒所导致肝脏代谢紊乱，且目前其发病率逐年升高[12-13]。近年来中医药对急性酒精性肝损伤具有显著的防治作用，其具有靶点性、多环节性，且不良反应小，具有明显的安全优势[14]。灵芝多糖是从中药灵芝中所提取的多糖成分，具有显著的保肝、免疫调节、抗衰老、抗肿瘤、降糖等作用[15]。肝细胞脂质过氧化会破坏细胞膜完整性，胞质内ALT及AST大量外漏，其异常升高也是评估肝功能障碍的重要敏感性指标[16];陈玉胜等[17]研究报道，灵芝多糖可通过抑制肝脏组织炎性反应递质的形成，继而降低一氧化氮合酶（NOS）活性，抑制机体炎性反应;还可通过抑制自由基脂质过氧化，保护细胞膜完整性，发挥保肝作用。本研究中实验组血清AST、ALT、三酰甘油、总胆固醇、游离脂肪酸、IL-1β、IL-6、TNF-α含量及油红O染色评分较模型组降低，提示灵芝多糖对急性酒精性肝损伤小鼠亦具有显著的保肝、降脂、抗炎、抑制脂肪沉积等作用。

目前关于灵芝多糖对急性酒精性肝损伤的抗炎、保肝作用机制尚未明确，NLRP3炎性小体是一种位于细胞质中的蛋白复合物，可通过活化Caspase-3促进炎性反应递质IL-1β、IL-18等分泌，诱导全身炎性反应，且崔东娟等[18]研究报道，香叶木素通过降低NLRP3炎性小体活性有效缓解肝损伤小鼠肝纤维化，发挥保肝作用。但目前关于灵芝多糖对肝组织NLRP3炎性小体表达的影响尚未见报道，本研究结果显示，实验组肝组织NLRP3炎性小体相对表达量较模型组显著降低，提示灵芝多糖可通过抑制肝组织NLRP3炎性小体表达，发挥抗炎作用，继而有效治疗急性酒精性肝损伤小鼠，但有关其他具体分子作用机制仍需进一步深入探讨。

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（2020-02-20收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：湖南省自然科学基金项目（2017JJ2350）作者简介：孙艳辉（1982.10—），女，硕士，住院医师，研究方向：血流动力学，E-mail：yu_dailin@163.com