心复力颗粒诱导缺氧无血清条件下H9C2心肌细胞自噬发挥抗凋亡作用的实验研究

陆培培，郭彩霞，马 杰，梁晓鹏，闫思雨，周宪梁，马丽红

心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)是全球最常见的死亡原因，已对人类健康构成严重威胁[1]。缺血性心脏病(ischemic heart disease，IHD)是最常见的心血管疾病，其患病率约占心血管疾病的25%。2015年研究数据表明，全球高达900万人死于IHD，使其成为致死率最高的疾病[2]。最新数据显示，IHD在高收入国家患病率呈下降趋势[3]，但在我国由于人口老龄化及城镇化进程的加速和心血管病危险因素的流行，IHD患病率迅速增长，已跃居我国居民死亡原因的首位[4]。因此，寻找治疗IHD的新药物，降低其死亡率，具有重要的临床意义。

细胞自噬是存在于真核生物细胞中的一种自我降解异常蛋白质和细胞器的生命活动，在细胞生存、分化和稳态维持中起到重要作用[5]。大量研究证实，细胞自噬参与调节缺血性心脏病的发生、发展和预后过程[1，6-7]，并与细胞凋亡途径关系密切[8-9]。当心肌缺血时，心肌损伤的形式包括细胞凋亡、坏死和新近提出的自噬相关性细胞死亡[9]。故减少心肌细胞凋亡能保护缺血性心肌损伤，延缓甚至阻断缺血后心力衰竭的发生。心复力颗粒(Xinfuli granules，XG)是施今墨传人丁鸣九先生创制的用于治疗心力衰竭的经验方改良制剂。前期研究发现该药能够抑制心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡[10]，改善能量代谢[11]，抑制心肌梗死后心肌纤维化和心室重构[12]，但目前对其抑制心肌细胞凋亡和纤维化的机制仍不清楚，研究表明诱导缺血心肌细胞自噬可抑制凋亡，改善心功能[13-14]。因此，本研究拟采用缺氧无血清 (hypoxia/serum-deprivation，H/SD)条件培养大鼠H9C2心肌细胞，体外模拟心肌缺血，探讨心复力颗粒对缺血心肌细胞凋亡和自噬的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株 大鼠心肌细胞H9C2购自上海拜力生物技术有限公司(ATCC)。

1.1.2 心复力颗粒溶液制备 心复力颗粒为我院内部制剂，由黄芪、人参、丹参、白芍、桂枝等组成，用水煎煮、真空浓缩、喷雾干燥、干式制粒，每包 5 g，含生药量18.1 g。将上述颗粒溶于DMEM培养基后置于60 ℃水浴锅中，超声震荡溶解，以3 000 r/min离心10 min后，再以孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，沉渣烘干用以计算药物溶液浓度，DMEM培养基定容至浓度为2 mg/mL，分装后于-20 ℃贮存备用。

1.1.3 主要试剂 DMEM培养基、青霉素-链霉素双抗及胎牛血清购自美国Gibco公司；细胞缺氧培养盒、厌氧发生袋、厌氧指示条均购自Mitsubishi Gas Chemical 公司；Western blotting 检测中所用的一抗均购自CST公司，二抗购自中杉金桥公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将H9C2心肌细胞在含有10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 mg/L链霉素的 DMEM培养基中进行培养，放置在 37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中，1～2 d 更换1次培养基，2～3 d 传代1次。

1.2.2 实验分组 ①药物浓度梯度实验：确定心复力颗粒保护心肌细胞的最适浓度，分为6组，分别为正常组(Normal)、缺氧无血清组(H/SD)、XG 100组(XG 100 μg/mL)、XG 200组(XG 200 μg/mL)、XG 400组(XG 400 μg/mL)、XG 800组(XG 800 μg/mL)。 ②抑制剂实验：分为5组，分别为正常组(Normal)、缺氧无血清组(H/SD)、XG组(XG 400 μg/mL)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(3-MA 5 μmol/L)、XG+3-MA组(XG 400 μg/mL+3-MA 5 μmol/L)。

1.2.3 体外缺氧模型的建立 取对数生长期的细胞接种于6孔板中，每孔接种1.0×105个细胞，培养24 h，弃去培养液，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗2次，加入适量DMEM无血清培养基，并按上述分组加入相应浓度的药物处理。将细胞置于含厌氧指示条的缺氧盒中，放入厌氧袋，迅速关闭缺氧盒。将缺氧盒放在37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中，继续培养24 h。

1.2.4 Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡 取经过相应处理后的细胞，用4%的多聚甲醛在室温下固定10 min，PBS洗涤2次，6孔板中每孔加入1 mL Hoechst 33342染液，室温避光反应30 min。弃去染液，PBS洗涤2次后在荧光显微镜下观察细胞凋亡形态并拍照。

1.2.5 MDC染色检测细胞自噬 取经过相应处理后的细胞，在培养基中加入100 μmol/L单丹磺酰尸胺(MDC)染液，室温避光反应30 min。弃去染液，PBS洗涤2次后加入适量含血清的培养基在荧光显微镜下观察细胞自噬颗粒并拍照。

1.2.6 Western blotting检测蛋白质表达水平 收取经过相应处理后的细胞，胞裂解液提取蛋白，蛋白质定量试剂盒(BCA)法测定蛋白浓度。以每孔30 μg总蛋白量上样进行SDS-PAGE电泳，将电泳产物转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入相应浓度的一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后用相应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育1 h，洗膜后曝光、显影、定影。目的蛋白含量以β-actin作为内参，通过Quantity One软件定量分析目的蛋白条带。

2 结 果

2.1 心复力颗粒抑制缺氧无血清条件下H9C2细胞凋亡 各组细胞经过相应处理后，通过Hoechst 33342形态学和凋亡蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3检测细胞凋亡。在倒置相差荧光显微镜下观察发现，缺氧无血清组细胞形态明显皱缩，大量细胞漂浮，贴壁细胞减少，而经过心复力颗粒处理的各组细胞皱缩及漂浮细胞数量均减少，贴壁细胞在数量上接近正常组，且具有一定的浓度依赖性，在药物浓度为400 μg/mL时保护作用最强。如图1所示，正常组细胞核大而均匀，呈现淡蓝色；缺氧无血清组细胞核明显固缩、碎裂，形态不规则；而心复力颗粒各浓度组细胞核形态变化随着浓度增加而逐渐接近正常组，在XG400组的细胞核形态最接近正常组。

同时Western blotting结果显示，缺氧无血清条件明显抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达，促进凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达。心复力颗粒处理后，可显著性抑制细胞凋亡，Bcl-2表达上调，Bax和Caspase-3的表达下调，且呈浓度依赖性，在XG400组作用最显著，从而表明心复力颗粒可抑制缺氧无血清条件下H9C2 心肌细胞凋亡。详见图2。

注：箭头指示凋亡细胞核。

注：内参为β-actin，各组实验至少重复3次。与Normal比较，*P<0.05,# P <0.01;与H/SD 比较,△P <0.01。

图2 各组Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白的表达水平比较

2.2 心复力颗粒诱导H/SD条件下H9C2细胞自噬 MDC染色可显示自噬过程中自噬小体的形成，是检测细胞自噬的有效方法。如图3所示，与正常组比较，缺氧无血清组自噬小体明显减少，而在XG各浓度组中，随着药物浓度增加，自噬小体数量明显增加，在XG400组最明显。同时作为自噬标志物微管相关蛋白1轻链3-β(microtubule associated protein 1 light chain 3β，LC3)蛋白表达水平与MDC染色结果基本一致，如图3所示，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ呈剂量依赖性增加，并在XG 400组表达水平达到峰值。

注:与Normal 比较,*P <0.05;与H/SD 比较,# P <0.05,△ P <0.01。

2.3 心复力颗粒通过诱导心肌细胞自噬而发挥抗凋亡作用 用自噬特异性抑制剂3-MA处理细胞后，与缺氧无血清组比较，细胞凋亡明显增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著减少，而凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达呈上升趋势。心复力颗粒400 μg/mL可削弱3-MA的促凋亡作用，上调Bcl-2和LC3的表达水平，下调Bax和Caspase-3的表达水平。结果表明心复力颗粒可以促进H9C2心肌细胞自噬而起到抑制凋亡的作用。详见图4。

注:内参为β-actin,各组实验至少重复3 次。与H/SD 组比较,*P <0.05,# P <0.01;与3-MA 比较,△ P <0.05,☆ P <0.01。

3 讨 论

IHD是由冠状动脉血流和心肌之间供氧需求失衡而导致的心肌细胞缺氧，最终发生凋亡和坏死，引起心肌损伤。近年来大量研究证实细胞凋亡参与IHD过程，造成心肌细胞减少，心肌纤维化和心室重构，最终发展为心力衰竭[15-16]，因此减少缺血心肌发生细胞凋亡可以延缓甚至阻断心力衰竭的发生。细胞凋亡过程涉及一系列基因的激活、表达和调控，其中最主要的成员包括Bcl家族和Caspase家族，其中Bcl-2作为凋亡抑制因子，其过表达抑制凋亡，Bax和Caspase-3作为凋亡促进因子，其过表达促进凋亡的发生[17-19]。

细胞自噬自20世纪50年代首次报道后，近20年来引起科学界的广泛关注，其既存在于机体的生理过程中，又参与多种病理生理过程，如肿瘤、神经退行性病变以及衰老[5]。研究发现，细胞自噬在IHD的发生和发展中起着重要作用，多数证据支持，细胞自噬在IHD中作为一种保护性机制发挥心肌细胞的保护作用，可能成为临床治疗IHD的新靶点[20]。Foglio等[13]研究发现急性心肌梗死后心肌梗死区细胞自噬增强伴随凋亡率减少，Bax/Bcl-2比值和Caspase-3活性下降。Zhong 等[21]研究表明诱导自噬可减少缺氧/再灌注条件下心肌细胞的凋亡，提高存活率，当用自噬抑制剂氯喹阻断自噬后，该心肌保护作用也消失。但有研究发现在心肌缺氧/再灌注过程中，细胞自噬扮演着双重角色，缺血期自噬增强促进心肌细胞存活，而当血流恢复后诱导自噬对心肌有损伤作用[22]。为了验证自噬在缺氧心肌中的作用，本研究选用H9C2心肌细胞在缺氧无血清条件下培养用以模拟体内缺血环境，以验证心复力颗粒对细胞凋亡和自噬的影响。

心复力颗粒由黄芪、人参、丹参、白芍、桂枝、葶苈子等组成，具有益气温阳、活血利水的功效。该复方在临床应用50余年，在治疗缺血后心力衰竭方面疗效显著。本课题组前期研究证实，心复力颗粒可改善异丙肾上腺素引起的大鼠心肌梗死和心室重构[23]，减轻心肌梗死后心肌纤维化[12]，保护缺血后心肌损伤。

本研究发现，与缺氧无血清组比较，心复力颗粒各组心肌细胞凋亡水平显著下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调，促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达下降，同时，细胞自噬相关蛋白LC3表达明显增强，且在心复力颗粒400 μg/mL时自噬水平达到高峰。采用自噬特异性抑制剂3-MA后，细胞凋亡增加，但该作用可被心复力颗粒削弱，表明心复力颗粒是通过诱导细胞自噬发挥抗凋亡作用。

本研究从细胞层面初步探讨了心复力颗粒在缺血性心脏病发病机制中的抗凋亡作用与自噬的保护作用，并在缺氧无血清培养条件下的H9C2心肌细胞中证实心复力颗粒通过诱导细胞自噬发挥抗凋亡作用，从而起到保护心肌的作用。