长链非编码RNA ANRASSF1在胃癌中的表达及其胃癌预后相关因素的分析

张 峰，唐建荣，王振东，邱红雨

(驻马店市中心医院消化内科，驻马店 463000)

胃癌(gastric cancer，GC)是常见的消化道恶性肿瘤，位列癌症相关死因第三位[1]。近年来，GC的治疗手段和诊断技术不断进步，但GC的发病率和死亡率仍没有改善[2]。早期GC患者可通过手术治愈，但大多数患者就诊时已处于晚期，这是GC患者预后不良的一个重要原因[3-4]。GC的异质性是导致其临床结局较差的另一个重要原因[5]。了解胃癌的分子异质性，有助于诊断和治疗。研究GC背后的分子机制，有助于找到胃癌新的诊断和预后生物标志物。lncRNA是非编码RNA长度超过200 bp的分子，参与基因表达、调控和各种细胞机制，如细胞分化、增殖、凋亡和细胞周期阻滞等[6-7]。ANRASSF1位于3p21.31，是内源性非剪接非编码RNA，通过招募多梳抑制复合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)到RASSF1A启动子上，降低RASSF1A(一种抑癌基因)的表达并促进细胞增殖。本研究主要检测ANRASSF1在胃癌组织和胃癌细胞中的表达水平，将ANRASSF1质粒转染至胃癌细胞中，检测其对胃癌细胞增殖和侵袭的影响，分析ANRASSF1的表达水平与胃癌患者临床特征的相关性及其对患者生存率的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞和试药

人胃黏膜细胞GES-1和人胃癌细胞MGC-803、SCG-7901、BGC-823均购于中国科学院基础医学院研究所基础医学研究中心；MCDB151培养液、RPMI1640培养液、lopti-MEM培养液、0.25%胰酶-EDTA均购于美国Gibco公司；青链霉素双抗购于碧云天生物技术有限公司；MTT粉末、结晶紫粉末和二甲基亚砜购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司；Transwell小室购于美国Corning公司(型号7030349，小孔为8.0 μm)；Trizol和反转录试剂盒购于赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 胃癌组织收集

收集2010年1月至2013年1月在我院接受胃癌手术治疗的患者组织，其中胃癌组织样本74例，胃癌旁组织样本32例。收集的组织样本先放置液氮中迅速冷冻，然后置于-80℃冰箱中待用。所用组织均由2名病理科医生做出诊断。本实验经过医院伦理委员会批准，患者及家属同意，并签署知情同意书。

1.3 qRT-PCR分析

按照Trizol试剂说明提取组织和细胞中的总RNA。ANRASSF1上游引物序列为5′-TTACCTCACACTGCTACG-3′、下游引物序列为5′-CGATAGAGATCCAACTGT-3′；ANRASSF1模拟物上游引物序列为5′-CGTCACCTCTTAGGCTTGGA-3′、下游引物序列为5′-CATTGGTGTCGTTGTGCTCT-3′。根据反转录试剂盒说明书进行逆转录，逆转录条件为42 ℃、60 min和72 ℃、10 min。cDNA采用Bio-Rad CFX96系统进行实时定量PCR检测ANRASSF1的表达，以U6作为内参。每个待测基因设4个复孔。数据通过Bio-Rad CFX96系统进行处理，按照公式RQ=2-ΔΔCT计算各组间的倍数关系。

1.4 质粒构建及转染

ANRASSF1质粒由广州市锐博生物科技有限公司构建。将ANRASSF1干粉用RNase-free H2O配制成20 μmol/L的储存液后，分装、冻存备用。胰酶消化MGC-803和SGC-7901细胞，并吹散成为单个悬浮细胞，离心洗涤后用无血清培养基(serum-free medium，SFM)1640培养基重悬，在每孔含有440 μl SFM培养基的24孔板中接种约2×105个/孔的细胞；将5 μl浓度为20 μmol/L的ANRASSF1加入到50 μl lopti-MEM中，轻轻混匀，室温孵育5 min；在上述混合液中加入5 μl转染试剂lipofeetamine 2000，轻轻吹打混匀，室温孵育15 min；将60 μl转染试剂抑制物混合试剂加入含有细胞的孔板中，轻轻混匀，ANRASSF1的转染终浓度为100 nmol/L；将培养板置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养48 h后进行PCR检测转染效率。ANRASSF1质粒转染至MGC-803和SGC-7901细胞后定义为ANRASSF1组，未转染质粒的细胞设为对照组。

1.5 MTT实验

采用MTT实验检测ANRASSF1质粒转染至MGC-803和SGC-7901细胞后细胞的增殖情况。将转染过的细胞以每孔2×103的密度接种于96孔板中，分别设置的培养检测时间为12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，每个检测时间点设置6个平行孔，20 μl MTT溶液加入检测孔中，继续孵育4 h。然后去除上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜溶液，振荡5 min后用酶标仪检测570 nm处的吸光度值(OD)，OD值与活细胞的数量成正比。

1.6 Transwell实验

ANRASSF1质粒转染至MGC-803和SGC-7901细胞中，检测细胞的侵袭能力。分别以2×104的密度接种于小室里面(含有matrigel，是一种细胞外基质)，用100 μl无血清培养基悬浮。在小室下部加入500 μl含有10%血清的培养基，孵育48 h。取出小室放入多聚甲醛中固定10 min，然后置于0.1%结晶紫中染色30 min。用棉签轻轻擦去小室上部未发生侵袭的细胞，然后置于显微镜下拍照，每个孔从上至下选择5个视野。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 ANRASSF1在胃癌组织和胃癌细胞中高表达

qRT-PCR检测结果显示，ANRASSF1在胃癌组织中的表达水平高于胃癌旁组织(P<0.01)，在胃癌MGC-803、SGC-7901、BGC-823细胞中的表达水平均高于永生化胃上皮细胞GES-1(P<0.001)，见图1。

2.2 ANRASSF1促进胃癌细胞MGC-803和SGC-7901的增殖

将ANRASSF1质粒转染至MGC-803和SGC-7901细胞中，ANRASSF1组细胞中ANRASSF1的表达量明显高于未转染质粒组(P<0.01)。MTT实验，细胞培养72 h时检测到转染ANRASSF1质粒组细胞数量明显高于未转染质粒组(见图2)。

2.3 ANRASSF1促进胃癌细胞MGC-803和SGC-7901的侵袭

细胞侵袭实验，将转染ANRASSF1质粒的细胞和未转染质粒的细胞在相同条件下培养48 h后检测到转染ANRASSF1质粒组发生侵袭的细胞数明显多于未转染质粒组(P<0.01)，见图3。

注：蓝紫色细胞为发生侵袭的细胞(结晶紫染色，×200)。A：MGC-803-ANRASSF1组细胞发生侵袭的细胞数明显多于MGC-803组，**PP图3 ANRASSF1促进胃癌细胞MGC-803和SGC-7901的侵袭

2.4 ANRASSF1与胃癌患者预后的相关因素分析和对生存率的影响

qRT-PCR检测胃癌组织中ANRASSF1的表达水平，高于胃癌旁组织平均水平的定义为ANRASSF1高表达组，低于胃癌旁组织平均水平的定义为ANRASSF1低表达组，χ2检验分析ANRASSF1的表达与胃癌患者性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、病理分级、淋巴结转移的相关性，结果见表1。ANRASSF1高表达组患者TNM分期较高，2、3级的病理分级人数较多且易发生淋巴结转移。ANRASSF1高表达组患者的生存率明显低于ANRASSF1低表达组(见图4和表1)。

注：ANRASSF1高表达组患者的存活率显著低于ANRASSF1低表达组，P图4 ANRASSF1高表达和低表达患者的生存率分析

临床特征ANRASSF1高表达组(例)ANRASSF1低表达组(例)χ2(P值)性别0.034(0.854) 男2219 女1716年龄0.148(0.701) ≤501515 >502420肿瘤大小(cm)0.690(0.406) ≤32721 >31214TNM分期4.841(0.028) Ⅰ/Ⅱ1825 Ⅲ/Ⅳ2110病理分级12.247(0.002) 1级821 2级2010 3级114淋巴结转移6.709(0.010) 阴性1524 阳性2411

3 讨论

ANRASSF1是一个内源性非剪接长链非编码RNA，它是从几个细胞系和组织中的RASSF1基因座反链转录而成并结合至PRC2上。ANRASSF1是通过RNA聚合酶II转录，定位在细胞核，与其他结合PRC2的lncRNAs相比，它的半衰期较短[8-9]。ANRASSF1在乳腺肿瘤和前列腺肿瘤细胞系中的表达高于非肿瘤细胞系。ANRASSF1异位过表达降低RASSF1A丰度，并增强HeLa细胞增殖，而沉默ANRASSF1后可出现相反的效应。ANRASSF1可导致抑癌基因RASSF1A的表达水平降低，因此肿瘤细胞更容易增殖[10]。最近的数据已经提出lncRNA在癌症相关的调控途径中起关键作用，并涉及多种细胞机制[11-12]。lncRNA具有原癌基因的功能，在乳腺癌中它的一些表达模式与雌激素受体(ER)、肿瘤组织学分级、患者预后相关[13-14]。有研究显示ANRIL和ANRASSF1在胃癌肿瘤中表达水平升高，且二者之间的表达有一定的相关性，预示ANRIL和ANRASSF1在胃癌的进展中起重要作用[15]。

本研究共收集54例胃癌组织样本，32例胃癌旁组织样本，通过qRT-PCR检测ANRASSF1的表达，结果显示在胃癌组织中ANRASSF1的表达明显增加。另外，本研究又选用3种胃癌细胞系和一种永生化胃上皮细胞，并检测细胞中ANRASSF1的表达情况，结果显示在3种胃癌细胞中ANRASSF1的表达也明显提高。为了进一步研究ANRASSF1在胃癌细胞中的作用机制，本研究将ANRASSF1质粒转染至MGC-803细胞中，使其在MGC-803细胞中过表达，通过细胞增殖实验检测到，ANRASSF1可促进胃癌细胞的增殖。另外，在小室中培养48 h后，ANRASSF1过表达的细胞的侵袭能力明显增加，说明ANRASSF1可促进胃癌细胞的增殖和侵袭。为了进一步分析ANRASSF1与胃癌患者的预后是否具有相关性，本研究根据胃癌组织中ANRASSF1的表达水平，将其分为ANRASSF1高表达组和低表达组，并分析与患者的性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、病理分级、淋巴结转移的相关性χ2检验结果显示，ANRASSF1的表达与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤大小无关，与TNM分期、病理分级、淋巴结转移相关。ANRASSF1高表达组中患者的TNM分期和病理分级较高，淋巴结转移阳性患者较多，因此说明ANRASSF1可促进胃癌的进展。另外，ANRASSF1高表达组患者的5年生存率明显低于ANRASSF1低表达组，可作为胃癌患者预后不良的一个预测指标。

综上，ANRASSF1在胃癌中表达增加，促进胃癌细胞的增殖和侵袭，在胃癌的发展过程中起重要作用，有望成为胃癌治疗的一个新靶点。