不同浓度盐存储液对纯钛表面碳累积效应的影响

唐恺洺，邱 憬

种植义齿是一种比较理想的缺失牙修复方式，具有美观舒适、不损伤邻牙等优点，越来越多的缺牙患者将其作为首选治疗方案。目前临床常用的口腔种植系统均采用纯钛种植体。体内外研究表明，钛的生物相容性与其表面特性密切相关，如表面形貌、亲水性、表面能、电荷、化学组成等。这些特性在钛种植体/骨界面发挥着关键作用，包括蛋白质吸附，成骨细胞的粘附、增殖、分化，硬组织形成等[1-3]。为此，国内外学者对钛种植体的表面处理进行了大量研究，以提高其成骨活性，促进骨结合[4-6]。

钛种植体在制作完成后，需经存储、运输、入库环节再进入临床应用。有研究发现，钛表面经过不同处理后，其生物相容性随时间延长出现衰退[7]，提示钛表面活性存在老化现象。而该现象与保存过程中钛表面的碳污染有关。Lu等[8]和Hayashi等[9]研究证实，暴露在空气中的钛表面会吸附空气中的碳氢化合物，由此形成的碳累积可进一步抑制钛表面的成骨细胞行为。目前，临床应用的种植体成品通常保存在含空气的无菌包装瓶或包装袋中，保存期最长可达5年之久。长久的空气存储，使得几乎所有种植体均存在不同程度的碳污染与生物活性老化。

针对这一问题，国内外学者通过研究提出了诸多抗老化方法，如紫外线照射、化学缓冲剂浸泡、含活性离子的水溶液浸泡、惰性气体存储等[10-12]。其中，盐存储液最为方便、经济，已开始逐渐进入临床应用。然而，盐存储液抗种植体老化的内在机理，即对钛表面碳污染的影响尚未见报道。因此，本实验拟采用盐存储液作为存储介质，通过扫描电镜观察、接触角测试、X射线光电子能谱分析等方法，探究不同浓度盐存储液对纯钛表面碳累积效应的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料与设备

纯钛片(99.5%，宝鸡钛业，中国)，SiC砂纸(天津南景，中国)，无水乙醇、氯化钠(分析纯，国药，中国)，超声清洗机(PS-20，DURADSONIC，中国)，扫描电子显微镜(1530VP，LEO，德国)，标准型光学接触角仪(SL200B，科诺，美国)，X射线光电子能谱仪PHI 5000(VersaProbe, Ulvac-Phi，日本)。

1.2 盐存储液及试件制备

盐存储液的制备：定量称取氯化钠粉末，双蒸水依次稀释为0.45%、0.9%、10%的氯化钠溶液。试件制备：选用直径5 mm、厚1 mm规格的纯钛圆片，SiC砂纸(320目、600目、800目、1200目)逐级打磨抛光，双蒸水、无水乙醇、双蒸水中依次超声清洗10 min，置于60 ℃烘箱中干燥后备用。将试件随机分为五组，分别密闭保存于空气、双蒸水(ddH2O)、0.45% NaCl、0.9% NaCl、10% NaCl溶液中2周，其中，空气组和双蒸水(ddH2O)组为对照组，三种盐存储液组为实验组。

1.3 钛表面微形貌观察

随机选取五种介质中存储14 d后的试件各1枚，超净台下自然晾干后，采用扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM)观察试件的表面微形貌。

1.4 接触角和表面能测定

检测接触角和表面能评价各组试件的表面亲水性。随机选取五种介质中存储14 d后的试件各3枚，在超净台下自然晾干。随后将2 μL蒸馏水滴在试件表面，采用标准型光学接触角仪测量试件的接触角及表面能，每枚试件随机测量5个点，记录平均值。

1.5 表面元素分析

采用X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)分析五种介质中存储14 d后的试件表面元素组成和化学态。入射X线：Al靶，电压15 kV，功率25 W，入射角45°。元素广谱分析：160 eV，元素高像素窄谱分析：40 eV。解析元素结合能参考数据库：National Institute of Standards and Technology XPS Online Database。根据峰面积和原子灵敏度因子进行表面元素含量和化学状态分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件对各组试件的接触角和表面能检测结果进行方差齐性检验，显示数据方差齐，进行单因素方差分析和S-N-K多重比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 钛表面微形貌

扫描电镜观察纯钛试件在五种介质中存储14 d后的表面微形貌见图1。各组试件表面均可见微小整齐的机械划痕。空气组和ddH2O组试件表面较为洁净，后者偶见微量晶体吸附，而三种盐存储液组试件表面可见散在分布的氯化钠晶体。该结果表明，盐存储液存储14 d后，纯钛试件表面会吸附部分氯化钠晶体，但试件的表面微形貌无明显改变。

2.2 接触角和表面能

五组纯钛试件的接触角和表面能测量结果见图2，3。对照组(空气组和ddH2O组)之间无显著差异。与对照组相比，盐存储液组的接触角明显减小，表面能亦随之增大，提示钛表面的亲水性得到了更好的留存。此外，该结果显示，盐存储液的浓度越高，钛表面的亲水性越好。10% NaCl组的表面能较0.45% NaCl组提高了约20 mN/m。

2.3 表面元素分析

五组纯钛试件表面元素的XPS分析结果见图4，5。图4-a的XPS广谱分析显示，各组试件表面均表达钛(Ti)、氧(O)、碳(C)信号，元素的化学态无区别，但各元素峰值随储存介质的不同而变化。碳高像素谱(图4b)及元素组成分析(图5)显示，空气组试件表面的碳含量最高(43.97%)，而钛含量(15.47%)和氧含量(36.80%)则最低，提示空气存储环境中，钛表面对二氧化碳及碳氢化合物的吸附较多。相对于对照组，盐存储液组试件表面的碳含量显著减少。10% NaCl组的碳含量降至最低的25.67%，同时钛和氧含量显著提高。该结果表明，纯钛试件在盐存储液中保存能有效减少碳累积，且盐存储液浓度越高，钛表面的碳累积越少。

图1 扫描电镜观察纯钛试件在空气、双蒸水(ddH2O)、0.45% NaCl、0.9% NaCl、10% NaCl溶液中存储14 d后的表面形貌

*：a，b,c,d,e代表5组，标注字母表示与该组有统计学差异

图2纯钛试件在五种介质中存储14 d后的接触角和表面能

Fig.2Contact angle and surface energy of pure titanium samples under five storage conditions after14days

图3 纯钛试件在五种介质中存储14 d后的接触角图像

3 讨 论

种植体骨结合是种植义齿成功与否的关键。具有良好亲水性的钛种植体表面能为骨结合创造更有利的生物学基础。亲水性钛表面能够诱导血液迅速扩散，形成生物活性因子的整体包覆，进而通过调节吸附蛋白的结合强度、总量和构象影响成骨细胞的早期粘附、增殖和分化[13]。因此，国内外学者广泛致力于钛金属的表面改性，期望通过不同的表面处理提高钛表面的亲水性，从而促进骨结合。Tallarico等[14]的临床研究发现，亲水性种植体相比传统喷砂酸蚀处理的种植体更具优势，可以有效缓解种植体周围骨重建阶段的ISQ值下降。得益于此，亲水性种植体开始逐步取代传统种植体。然而，Wael等[15]研究发现，随着时间延长，钛表面存在生物活性向生物惰性的老化过程，表现为亲水向疏水转变。Hayashi等[9]通过细胞实验进一步证实，与新鲜制备的钛表面相比，保存4周后钛表面的蛋白吸附以及成骨细胞粘附、分化能力显著降低。因此，如何有效保存钛种植体活性以延缓其自然老化成了近年来的研究热点。

Wennerber等[16]研究指出，保持生物材料表面活性的一种有效方法是减少大气中的碳氢化合物污染。碳氢化合物污染，即碳累积现象，会改变钛表面的元素组成和表面能，进而干扰蛋白质吸附和成骨细胞的粘附、增殖、分化，最终影响骨结合。近年来，有学者提出利用紫外线照射钛表面，还原钛表面的碳氢化合物，保持其表面活性[17]，但也有研究认为，随着时间的推移和能量的自然释放，由紫外线诱导的超亲水性表面难以长期维持[18]。因而，有学者提出将紫外线处理的新鲜钛表面置于ddH2O[19]或阿仑膦酸盐[20]中保存，使钛表面活性获得有效存留。上述研究表明，液体存储的抗老化作用较其他方式更为长久、有效。作为一种基础溶液，盐溶液是最经济的存储介质，在种植体存储方面具有良好的应用前景。因此，阐明其抗老化的作用机理，探索其浓度与抗老化效应之间的量效关系，可为新型种植体存储介质的研发提供重要参考依据。

图4 纯钛试件在五种介质中存储14 d后的XPS广谱(a)和高像素谱(b)分析

图5 纯钛试件在五种介质中存储14 d后的表面元素组成

为探究盐存储液抗钛表面老化的作用机理，我们选用三种不同浓度的氯化钠存储液，并以空气和ddH2O为对照组。五种存储条件保存纯钛试件14 d后，进行理化性质检测。扫描电镜观察发现，空气组和ddH2O组钛表面相对洁净，三种氯化钠存储液组的钛表面可见散在分布、大小不一的氯化钠晶体附着。五组试件表面均可见方向一致的机械划痕，其微形貌无明显区别，提示不同存储条件不会改变光滑钛表面的微形貌，该结果与Lu等[12]的研究结果一致。随后我们测量了五组试件的接触角，发现空气组和ddH2O组无明显差异，而三种盐存储液组的接触角显著减小。更加有趣的是，随着盐存储液浓度的升高，接触角逐渐递减，提示盐存储液的浓度会影响钛表面亲水性的存留，五组试件表面能的测定进一步验证了这一发现。为了阐明该现象的内在机理，我们对五组试件的表面元素进行了XPS分析。五组试件表面的主要元素一致，均为Ti、O、C。不同的是，三种盐存储液组的碳含量更少，而钛和氧含量相对较多。在三种盐存储液中，随着浓度的增加，碳含量依次减少。该结果与亲水性测试相一致。以上结果说明，盐存储液通过减少钛表面的碳累积，保存了其亲水性，且浓度越高，这种抗老化效应越明显。

新鲜制备的钛表面在液体中带正电荷[15]，按照电化学理论，当金属电极与电解质溶液接触时，在界面因素的作用下，电极和溶液相之间形成一个在结构和性质上与本体溶液不同的过渡相，形成界面双电层。紧靠电极表面的内层为吸附的水分子偶极层和特性吸附离子(如氯离子等)，这些离子部分或全部去水化，外层为水化离子层，通过静电作用吸附至表面。由Boltzman公式可知，电解质浓度越高，双电层离子浓度越高[21]。基于此理论可知，低浓度氯化钠存储液中，界面双电层的水化钠离子密度较小，溶液中的碳氢化合物可以穿过双电层吸附至钛表面。当盐存储液浓度升高时，双电层水化钠离子密度增加，碳氢化合物难以穿过而被隔离在双电层之外(图6)，从而减少了钛表面的碳累积，有效保留了亲水性。

图6 盐存储液浓度影响钛表面碳累积效应的作用机理示意图

综上所述，我们发现盐存储液通过减少钛表面的碳累积，有效保存了钛表面的亲水性，提出盐存储液的浓度会对钛表面的碳累积效应产生影响，并对其内在机理进行了推理解释。将种植体存储在盐溶液环境中具有抗老化的独特优势，但盐存储液的最优浓度仍需进一步结合生物相容性实验予以确定。在此基础上，新型种植体存储液的溶剂、溶质种类及其浓度有待于深入而广泛的探索。