脂联素受体在人牙龈成纤维细胞中的表达研究

王丽美，支 敏，吕沛颖，高鹏飞，蔺 晨，杨艳艳，王永兰

牙周炎是以菌斑微生物为始动因子的感染性疾病。大量流行病学研究表明,牙周疾病与肥胖(特别是腹型肥胖)密切相关[1-3]。脂联素(Adiponectin, APN)是脂肪组织产生的生物活性分子，作为一种负性调节因子，它可促进脂肪酸的氧化、增加胰岛素敏感性、抗炎等[4-5]。脂联素表达水平在肥胖与牙周炎患者中均下降[6-7]。脂联素与其受体结合发挥生理作用，目前发现脂联素受体中发挥作用的主要为两种：脂联素受体1(adiponectin receptor 1,AdipoR1)和脂联素受体2(adiponectin receptor 2,AdipoR2)[8]。脂联素在与受体结合后，激活其位于膜内的N端，使其和APPL1接头蛋白相连接，激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK)和氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)-α配体，参与葡萄糖、脂肪代谢调节,发挥抗炎、抗糖尿病等作用[9-10]，因此在靶组织中AdipoR1和AdipoR2表达量的改变均有可能直接影响脂联素的作用效能。

对肥胖相关疾病的研究[1]表明:肥胖不仅可以降低血清脂联素水平，还可以降低靶器官AdipoR1和AdipoR2水平，使其对脂联素的敏感性下降，形成 “脂联素抵抗”，进一步产生胰岛素抵抗[11]。然而对于牙周组织而言，牙周炎症环境对脂联素受体表达的影响至今仍存在争议。Nokhbehsaim等[12]认为在人牙周膜细胞中P.gLPS促进了脂联素受体的表达，而Yamaguchi等[13]则认为牙周炎症状态会下调人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)脂联素受体的表达。脂联素受体的表达水平与牙周炎的关系存在争议，有必要进一步研究,从而为阐释肥胖与牙周炎相关性的内在机制提供依据。本研究通过肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.g)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、APN刺激HGFs并测定其脂联素受体表达的情况来探讨脂联素受体表达与牙周炎症的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 HGFs的培养及分组 选取自2017年3月—2017年5月在天津医科大学口腔医院颌面外科就诊的需要拔除埋伏阻生智齿患者，共5位(年龄18～24岁，平均22岁)。排除患有全身系统性疾病如糖尿病、心血管病等，妊娠，吸烟，近3个月内使用抗生素史者，患者知情同意(经天津医科大学伦理审查委员会审查同意)。

术中收集新鲜且色形质正常、无明显炎症的牙龈组织,运用组织块培养法培养原代HGFs并进行传代，当细胞传至4～6代时将细胞接至12孔板进行实验，随机分为4组，每组4孔：空白对照组(10%FBS培养基)；TNF-α刺激组(50 ng/mL TNF-α+10% FBS培养基刺激)；P.gLPS刺激组(0.1 μg/mLP.gLPS+10% FBS培养基刺激)；APN刺激组(1 μg/mL APN+10% FBS培养基刺激)。

1.1.2 主要试剂及仪器 RT-PCR试剂盒(sigma公司，美国)；引物(生物公司，上海)；P.gLPS(InvivoGen公司，美国)；TNF-α (Peprotech公司,英国)；APN(Peprotech公司,英国 )。

1.2 方法

1.2.1 HGFs的培养与鉴定 运用组织块培养法培养原代HGFs并进行传代,通过显微镜下形态学观察与细胞免疫细胞化学法-SP法鉴定所培养的细胞为中胚层来源的人牙龈成纤维细胞,且不含上皮细胞。

1.2.2 RT-PCR检测 Trizol提取人牙龈成纤维细胞总RNA, superRTcDNA逆转录试剂盒合成cDNA,引物序列:AdipoR1(169 bp) ：(5′-CGAGAGGGCCTAGGATTGGA-3′)和(5′-CTGATGGTAGACAAGCCGGG-3′), AdipoR2 (213 bp)：(5′-AGACACGCGGATCAACTCAC-3′)和(5′-TGCACCCCAATCGGTT-TTCT-3′)，β-actin：(268 bp)(5′-CCATCCTGGCCT-CGCTGT-3′) 和(5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′),95 ℃预变性约5 min；94 ℃变性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸10 min，电泳，凝胶成像仪拍照，目的基因与β-actin灰度积分比值表示基因表达水平。

1.2.3 TNF-α或P.gLPS或APN刺激HGFs 取5代HGFs(1×105个/孔)均匀铺在12孔板上，于37 ℃，5%的CO2温箱内孵育2 d使细胞贴壁融合至80%时。根据组别在12孔板内每孔依次加入50 ng/mL TNF-α 2 mL，0.1 μg/mLP.gLPS 2 mL，1 μg/mL APN 2 mL，空白对照(10%FBS培养基)2 mL,每组均设置3个复孔，于37 ℃，5% CO2温箱孵育1 d，将培养液丢弃，提取培养0、0.5、12、24 h的HGFs的总mRNA。

1.2.4 real-time PCR检测 用real-time PCR检测各组HGFs中AdipoR1和AdipoR2的表达，以β-actin作为内参，2-△△ct法处理数据，与对照组进行比较。

1.3 统计学方法

用IBM SPSS Statistics 23.0统计软件对实验所得数据进行数据分析，结果均采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素ANOVA方差分析(完全随机设计)，以P<0.05认为具有显著性差异。

2 结果

2.1 HGFs的培养与鉴定

组织块培养法培养HGFs，3 d后可见组织边缘隐约有成纤维细胞样细胞游出,细胞极性较强，排列呈漩涡状(图1A)。当细胞汇合至80%～90%时，进行首次传代，随培养时间和代数增加，细胞形态单一呈长梭型(图1B)。免疫组化结果显示细胞抗波形蛋白染色阳性(图2A)，抗角蛋白染色阴性(图2B)，证实所培养的细胞为中胚层来源，并未混杂任何上皮源性细胞。

A:原代HGFs第3天细胞从组织周围爬出；B:第4代HGFs

图1细胞形态学观察(×100)

Fig.1Morphological observation (×100)

A: 细胞抗波形蛋白染色阳性;B:细胞抗角蛋白染色阴性

图2HGFs组织来源的鉴定(免疫组织化学SP法)

Fig.2Identification of source of HGFs(Immunohistochemistry SP)

2.2 RT-PCR检测结果

如图3所示，健康HGFs中有AdipoR1、AdipoR2的表达，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物显示目的基因片段与预期一致，且AdipoR2的条带亮度更高。

图3 RT-PCR检测健康HGFs AdipoR1、AdipoR2的表达

2.3 real-time PCR检测结果

与空白对照组相比，各时间点TNF-α均明显下调HGFs的AdipoR2 mRNA的表达，上调HGFs的AdipoR1的 mRNA的表达，且有统计学差异(P<0.05)，图4A。与空白对照组相比，在培养0.5、12 h时P.gLPS上调HGFs的AdipoR1和AdipoR2的表达，且有统计学差异(P<0.05)，在24 h时，与空白对照组相比，P.gLPS上调HGFs的AdipoR2表达，但无统计学差异(P>0.05)，图4B。与空白对照组相比，在0.5、12、24 h时，APN均显著上调了HGFs的AdipoR1和AdipoR2的表达，且有统计学差异(P<0.05)，图4C。

各组AdipoR1、AdipoR2 mRNA水平是与空白对照组数值比较的相对率，*:AdipoR1基因水平和对照组相比,P<0.05,**:AdipoR2基因水平和对照组相比,P<0.05

A: 50 ng/mL TNF-α刺激；B: 0.1 μg/mLP.gLPS刺激；C: 1 μg/mL APN刺激

图4不同因子对HGFs脂联素受体AdipoR1、AdipoR2 mRNA表达的影响

Fig.4Effects of different factors on the expression of adiponectin receptor genes (AdipoR1and AdipoR2) in HGFs

3 讨 论

2003年，Yamauchi等[14]首先从细胞内克隆出两个脂联素特异性受体亚型，将其命名为AdipoR1/R2。国内外关于脂联素受体在牙周组织的表达研究不完全相同[13，15]。本实验证实人牙龈成纤维细胞只表达两种脂联素受体，这与文献[16]的结论一致。同时本研究表明AdipoR2条带较AdipoR1更亮，在人牙龈成纤维细胞中，脂联素受体表达可能以AdipoR2为主，这与Yamaguchi等[13]关于小鼠牙龈组织脂联素受体的表达研究结果一致，进一步探讨需要siRNA实验和蛋白实验证实。

在炎症状态的牙龈组织中，TNF-α作为一个多向性感染细胞因子发挥着及其重要的作用。在牙周炎患者的龈沟液和牙龈组织中，TNF-α含量明显增高[17]。本实验所用TNF-α因子浓度和刺激时间基于Yamaguchi等的研究[13]，且在前期预实验中人重组TNF-α(50 ng/mL)被证实可明显抑制HGFs脂联素受体表达。循环脂联素水平与血清TNF-a水平负相关[18]，具体机制不明确，可能是由于TNF-α可抑制PPAR-a通路[19]和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)活化通路[20]。TNF-α有两个不同受体，TNF受体-1(TNF receptor-1,TNFR1)和TNF受体-2(TNF receptor-2,TNFR2)。目前主要观点认为，TNFR1介导了核因子(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路的激活和成骨分化的抑制[21]，也有研究表明TNFR1诱导的信号通路可以破坏胰岛素作用[22]。我们发现培养0.5、12、24 h时TNF-α明显下调AdipoR2 mRNA的表达，上调AdipoR1 mRNA表达。这与Yamaguchi等[13]的研究不同，其结果表明：高浓度TNF-α在0.5 h和1 h明显抑制AdipoR1的表达,对AdipoR2的表达无影响。AdipoR1在与APN结合后主要激活下游AMP及肝脏激酶B1(liver kinase B1,LKB1)分子，激活AMPK通路，促进脂肪酸氧化与葡萄糖摄入[23]；而AdipoR2在与APN结合后主要激活下游PPARs(包括如PPAR-α和PPAR-γ配体)，激活PPAR信号通路，促进脂肪酸氧化[24]。AMPK及PPARs等信号通路的激活在一定程度上可以拮抗NF-κB信号通路[25]，促进巨噬细胞向M2型(抗炎型)极化[26]从而抑制炎症反应。有研究证实脂联素可能主要通过AdipoR2调节胰岛素敏感性和发挥抗炎作用[27]，且本研究表明在HGFs中脂联素受体表达以AdipoR2为主,因此TNF-α下调AdipoR2 mRNA的表达可能是TNF-α降低脂联素敏感性和发挥促炎作用的重要原因，而TNF-a对牙周组织AdipoR1表达的影响尚需更多研究来证实和解释。

P.gLPS作为重要毒力因子常被用于体外构建牙周炎模型[28]。本研究表明：P.gLPS促进HGFs表达AdipoR1和AdipoR2,这与Nokhbehsaim等关于人牙周膜细胞的体外实验[12]结论一致:在1 d时，P.g显著增加了脂联素受体AdipoR1的mRNA表达,在1 d和3 d上调脂联素受体AdipoR2的表达,但无统计学差异。Yamaguchi等[13]则认为P.gLPS并不会影响到牙龈成纤维细胞中脂联素受体表达水平。目前各研究结果存在争议，需更多实验证实P.gLPS诱导的信号通路在HGFs脂联素受体表达中的作用。

有研究在对牙周炎患者的血清及牙龈组织活检中，发现其脂联素浓度下降[29]。那么脂联素浓度的降低是否会影响脂联素受体的表达？本实验所用APN浓度为1 μg/mL(在正常龈沟液脂联素浓度范围内[6])，同时本研究表明，脂联素在该浓度作用下相较于空白对照组明显上调AdipoR1和AdipoR2 mRNA表达，这提示我们脂联素在一定程度上可对其自身受体正向调节。在牙周炎患者中，脂联素的表达水平下降[29]，有可能引起脂联素受体AdipoR1/2的mRNA表达下降，使脂联素作用效能在一定程度上降低，产生脂联素抵抗。这一结果与Nokhbehsaim等的研究[12]并不一致，他们的结果表明，脂联素在第1天时下调了两个脂联素受体的表达，截至目前实验结果仍然存在争议，脂联素对自身受体的调控仍然需要进一步研究。

牙周炎的发生和发展极其复杂，由一复杂的菌斑生物微环境来调控，其它细菌致病成分或者炎症因子，如白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等是否会影响脂联素受体的表达值得进一步研究。在牙周炎症状态下，脂联素受体表达下降，及时辅助APN受体激动剂等局部药物治疗对于控制炎症、防止病情加重有一定意义[30-31]。此外，脂联素受体研究可以进一步了解脂联素的作用及牙周炎、肥胖的分子机制，从而为设计以AdipoR1和AdipoR2受体激动剂作为靶点药物辅助应用于肥胖伴牙周炎患者治疗提供基础。最近已有研究表明，脂联素受体激动剂AdipoRon (APR)在肥胖相关糖尿病动物模型中不但可以降低血糖含量，还可以显著降低炎症牙龈中CC趋化因子配体2(CC chemokine ligand 2,CCL2)和IL-6的含量，同时降低破骨细胞数量进而改善牙周状况[31]，证实APR可作为肥胖相关性糖尿病合并牙周炎患者的多效靶向药物，为这类患者的有效治疗带来福音。