厄贝沙坦减轻糖尿病肾病大鼠肾损伤

张 娅，黄文辉*，侯智敏，刘菊香，刘 静

(1.甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000； 2.甘肃中医药大学 临床医学系，甘肃 兰州 730000)

根据最新出版的国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation，IDF)地图集估算的数据提示，全球共有4.25亿糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者，预计到2040年将会突破6.42亿[1]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是终末期肾脏疾病(end-stage renal disease, ESRD)和糖尿病患者导致残疾以及高病死率的一个重要原因。早发现、早期防治DN对于减少并发症、发病率和病死率以及减轻DN负担对于社会和经济影响至关重要。

目前关于DN的发病机制及干预中主要还是针对肾脏血流动力学异常活跃的肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)[2]。血管紧张素II受体拮抗剂(angiotensin Ⅱ receptor antagonist，ARB)的肾保护作用不仅表现在对血流动力学的影响上，而且表现在对非血流动力学因素的阻断上。ARB阻断RAS抑制肾组织TGF-β1，这是ARB治疗DN的重要机制。已有研究证实，厄贝沙坦(Irbesartan)对健康人血浆miRNA谱的表达具有调控作用[3]，且厄贝沙坦在临床应用广泛，因此选择厄贝沙坦，探讨其在DN中对miRNA谱表达的调控，分析其中可能起作用的miRNAs及其作用靶基因，进一步探讨厄贝沙坦改善肾脏功能的相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性10周龄Wistar大鼠共30只，体质量200～230 g[甘肃中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK(甘)2017-0004]。

1.1.2 主要试剂：厄贝沙坦[赛诺菲(北京)制药有限公司]；链脲佐菌素STZ、Trizol试剂、氯仿、无水乙醇、异丙醇、DEPC水，反转录试剂盒、荧光定量试剂盒及引物、蛋白提取试剂 RIPA、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、蛋白酶抑制剂 cocktail、Western blot常用试剂、免疫组化常用试剂、PBS、ECL 超敏发光液、HE、Masson染色常用试剂(广东锐博生物科技有限公司)；TGF-β1、ZEB 1和Col 1兔抗大鼠多克隆抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组及处理：将大鼠随机分为对照组和DN组(高脂饲料喂养：基础饲料73.6%，猪油15%，胆固醇1.2%，胆酸钠0.2%，蛋黄粉10%，经机器生产压制成条状，喂养结合腹腔注射小剂量STZ，n=20只)，第6周末大鼠隔夜空腹腹腔注射小剂量链脲佐菌素STZ(28 mg/kg)，继续以高脂饲料喂养。对照组大鼠腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液。注射STZ间隔72 h后，以两次随机血糖等于或大于16.7 mmol/L为糖尿病大鼠模型制作成功。第14周末，将随机血糖≥16.7 mmol/L，ACR≥300 μg/mg时认为糖尿病肾病造模成功。将DN大鼠随机分为：DN 模型组(0.9%氯化钠溶液灌胃，n=10)、厄贝沙坦组[50 mg/(kg·d),n=10]，连续饲养至22 周龄。

1.2.2 常规实验室检查：于22周测体质量、随机血糖、24 h尿微量白蛋白、血肌酐和尿素氮。

1.2.3 肾组织病理学的观察：常规石蜡包埋切片行HE、Masson染色，普通光学显微镜下观察肾脏病理变化。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测miR-192 mRNA：肾脏组织研磨后裂解组织，按照Trizol试剂的标准操作步骤抽提总RNA，并用分光光度计测定其浓度，检测A260 nm/280 nm比值，判断RNA的纯度。应用Bulge-LoopTMmiRNA RTPrimer将 miRNA反转录成cDNA。以反转录合成的cDNA为模板，应用SYBR Green Mix进行实时PCR分析。实时PCR条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，循环40次。随后在70 ℃～95 ℃的区间内进行融解实验。以U6RNA作为内参照，循环阈值(Ct)比较法进行目的基因表达的相对定量分析。目的基因相对表达量=2-ΔΔCt，2-ΔΔCt表示的是糖尿病肾病组和厄贝沙坦治疗组目的基因表达相对于正常对照组的变化倍数。ΔΔCT=(Ct目的-Ct内参)实验-(Ct目的-Ct内参)对照。

1.2.5 Western blot检测靶蛋白：提取蛋白用BCA 法测蛋白浓度后100 ℃水浴变性5 min。上样，8%～10% SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，依次加一抗、二抗，ECL显色试剂，X线片曝光、显影。

1.2.6 免疫组织化学法检测靶蛋白：组织固定、脱水、浸蜡、切片，石蜡切片常规脱蜡至水洗，抗原修复，封闭，与一抗结合，与二抗结合，DAB显色，脱水，透明，封片，光镜观察及照相。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 厄贝沙坦对糖尿病肾病大鼠一般指标的影响

与对照组比较，模型组大鼠体质量、随机血糖、血肌酐、尿素氮和24 h尿微量白蛋白显著增高(P<0.05)；与模型组比较，厄贝沙坦治疗组大鼠体质量、随机血糖、血肌酐、尿素氮和24 h尿微量白蛋白显著降低(P<0.05)，厄贝沙坦治疗可以改善DN大鼠的一般情况(表1)。

2.2 肾脏病理HE、Masson染色结果

DN组大鼠肾小球分叶状，系膜区增宽，系膜基质增加，小管上皮细胞可见颗粒和空泡样变性；Masson结果可见DN组大鼠肾小球及肾间质区染色阳性物质，提示纤维化病变；与DN组相比，厄贝沙坦组大鼠肾组织病理改变有所改善(图1)。

2.3 Real-time PCR检测的结果

与对照组相比，模型组miR-192 在DN大鼠肾脏的表达下调(P<0.05)；与模型组相比，厄贝沙坦组miR-192的表达上调(P<0.05)(图2)。

2.4 大鼠肾组织TGF-β1、ZEB1蛋白表达

与对照组大鼠相比，DN模型组肾组织的TGF-β1、ZEB1蛋白表达量明显增加；与模型组相比较，厄贝沙坦治疗可以减少TGF-β1、ZEB1蛋白的表达(P<0.05)(图3，表2)。

表1 各组大鼠的一般指标结果比较Table 1 Comparison of general index results of rats in each

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with DN group.

图1 3组大鼠肾脏组织 HE、Masson 染色Fig 1 HE and Masson staining of kidney tissues of rats in three groups(×400)

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 com⁃pared with DN group图2 PCR检测各组大鼠肾组织 miR-192 的表达水平Fig 2 Quantitative RT-PCR to detect the expression of miR-192 in kidney tissues of rats in each

2.5 大鼠肾组织TGF-β1、ZEB1、collagen Ⅰ蛋白表达

TGF-β1 主要沉积于肾小管上皮细胞；ZEB1和collagen Ⅰ主要沉积于近端小管和远端小管上皮细胞。与对照组大鼠相比，DN组肾组织TGF-β1、 ZEB1、collagen Ⅰ蛋白表达增强；与DN组相比较，厄贝沙坦治疗组TGF-β1、ZEB1、collagen Ⅰ蛋白表达减弱(P<0.05)(图4，表3)。

图3 3组大鼠肾脏组织 TGF-β1、ZEB1蛋白表达水平Fig 3 Expression levels of TGF-β1 and ZEB1 in kidney tissue of rats in three groups

表2 各组大鼠肾脏TGF-β1、ZEB1的蛋白比较

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with DN group.

图4 3组大鼠肾脏组织 TGF-β1、ZEB1、collagen Ⅰ蛋白免疫组化结果

表3 各组大鼠肾脏TGF-β1、ZEB1、collagen Ⅰ蛋白免疫组化吸光度值比较

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with DN group.

3 讨论

DN发病机制非常复杂，TGF-β1是一种调节肾脏纤维化和炎性反应的重要细胞因子。TGF-β1通过促进细胞和基质之间的黏附来进行ECM的积累。miR-192在肾脏中特别是在肾皮质中高度表达，许多研究证实了miR-192在肾脏纤维化中起着重要作用，但对于miR-192在DN中的作用目前仍存在争议。

为进一步研究 miR-192 在DN发病机制中的作用，以及厄贝沙坦对DN大鼠miR-192表达的影响，选择DN Wistar大鼠作为研究模型，本研究发现厄贝沙坦对于大鼠肾组织miR-192的表达具有一定的影响。TGF-β1可以通过上调或下调包括miR-192在内的几个小RNA来控制肾纤维化的进程[4-9]。miR-192在肾组织中高度富集，TGF-β1抑制了人近端小管细胞(proximal tubular cell，PTC)中miR-192的表达，而miR-192的缺乏与DN中的肾纤维化加速和GFR减少有关[10]。糖尿病患者的活检显示miR-192水平较低，而且随着病程的发展,miR-192在肾组织的表达越低,其下调促进了人类DN中的纤维化进程[11]。然而，有几项研究得出了相反的结论[12-14]。这些研究发现，肾脏的miR-192在db/db小鼠和T2DM患者的MCs和TECs中过度表达，而miR-192的增加与TGF-β1的增加平行。因此，本研究结果提示 miR-192 可能参与了 DN 的发病机制，厄贝沙坦对DN的保护作用可能是通过调控miR-192的表达水平实现的。

通过文献检索发现，TGF-β1、ZEB1是与 DN 相关的 miR-192靶基因。糖尿病患者肾活检显示TGF-β1的表达显著增加。锌指E盒结合同源盒1(ZEB1)和ZEB2是位于TGF-β1信号通路下游的两个转录因子，可以抑制E-钙黏蛋白并调节肾纤维化。miR-192的过度表达可通过抑制ZEB1和ZEB2的表达来抑制TGF-β1介导的E-钙黏蛋白下调，进而阻止肾脏纤维化。因此，TGF-β1抑制了miR-192的表达，而miR-192靶向ZEB1/2激活了TGF-β1信号通路，加重了DN的肾纤维化[10]。Collagen Ⅰ是细胞外基质的主要成分，Collagen Ⅰ的合成能力和Collagen Ⅰ结合GBM的结合能力均导致糖尿病和糖尿病肾病患者循环纤维连接蛋白升高[15]。研究发现，高葡萄糖浓度可刺激肾小球系膜细胞中Collagen Ⅰ的合成，这种作用由TGF-β1介导。

因此，通过本研究，推测厄贝沙坦可能通过阻止大鼠肾组织miR-192表达的减少，进而下调靶基因TGF-β1、ZEB1的表达来阻止 ECM 沉积，延缓 DN 肾小球硬化和间质纤维化的发生。该机制研究有待于更进一步的探讨和验证。