安络小皮伞提取物对运动外伤的镇痛作用*

吴严冰

（郑州大学体育学院，河南 郑州 450000）

安络小皮伞（Marasmiellus androsaceus） 因其有黑褐色、细长密集的针状菌索，所以民间又称鬼毛针、茶褐小皮伞，是一种生长在密林中的真菌，属白蘑科 （Tricholomataceae） 皮伞属 （Marasmius）[1]。安络小皮伞菌是一种具有很高价值的中药，含有多种镇痛成份，常被用于治疗跌打损伤、骨折等外伤，也用于偏头痛、坐骨神经痛和风湿等病症的镇痛治疗，具有通经活络，活血止痛的功效[2]。

1 安络小皮伞多糖的镇痛作用

安络小皮伞中具有镇痛作用的化学物质有多种，有研究认为是麦角甾醇等甾醇类化合物、羟基肉桂酸等有机酸，也有研究认为是其多糖、糖蛋白类物质，还有认为是一些生物碱和黄酮类化合物具有镇痛作用[2]。经综合考虑，提取有效成分加以分析，根据其成分理化性质不同，利用特征显色、沉淀反应对安络小皮伞有效成分进行定性检查。

2 安络小皮伞生物碱类定性试验

制备酸性乙醇供试液用于检查安络小皮伞内是否含有生物碱[3]。安络小皮伞菌样品粉末由湖北欣恺生物科技有限公司生产（含水量≤10%，乙醇提取物≥50%）。称取安络小皮伞粉末1 g，加入0.5%盐酸乙醇溶液5 mL，在60℃水浴中回流15 min，立即过滤，得酸性乙醇提取液备用。

生物碱检查采用硅钨酸试验、碘化铋钾试验和碘化汞钾试验3种方法来检测[3]。观察试管反应现象，硅钨酸试剂滴入后产生浅黄色或灰白色沉淀物；碘化铋钾滴入后产生浅黄色或红棕色沉淀物；碘化汞钾滴入后产生白色或淡黄色沉淀物。上述试验均表明安络小皮伞粉末样品中含有生物碱成分。

3 安络小皮伞多糖含量检测

通过安络小皮伞中的多糖活性物质测定和分析，以确定其药理活性的主要成分。多糖的含量检测方法采用比色法进行检测，应用苯酚-硫酸法测定安络小皮伞多糖中总糖含量。采用苯酚-硫酸法验证多糖检测方法。

3.1 安络小皮伞多糖样品溶液制备

取安络小皮伞粉末0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.6 g、0.7 g、0.8 g、0.9 g、1.0 g，分别加蒸馏水至50 mL。放入恒温水浴锅在（90±2）℃条件下回流提取2 h。取出后得到安络小皮伞多糖样品溶液10组。

3.1.1 标准曲线制作

取葡萄糖对照品溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL，加蒸馏水至2 mL。加入浓度为6%苯酚溶液1 mL，快速混合均匀、再加入浓硫酸5 mL快速混合均匀。放入恒温箱在（25±2）℃条件下静置1 h。在500 nm波长处用紫外可见分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线。

3.1.2 多糖样品总糖含量测定

将安络小皮伞多糖粉末稀释至标准曲线之内的浓度，得到多糖粉末稀释液，在1 mL稀释液中加入浓度6%的苯酚1 mL快速混合均匀，再加入浓硫酸5 mL快速混合均匀。放入恒温箱在（25±2）℃条件下静置1 h。在510 nm波长处用紫外可见分光光度计测吸光度，代入回归方程求出样品粗多糖中总糖含量。

3.1.3 测试溶液稳定性

任取1份安络小皮伞多糖样品溶液，分别于显色后 0、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h 测定其于510 nm处的吸光度，对多糖样品溶液的稳定性进行测量。

3.1.4 方法的精密度考察

计算上述10组安络小皮伞多糖样品的提取率、平均提取率以及相对标准偏差，以此考察方法精密度。

3.1.5 加样回收率考察

任取5份安络小皮伞多糖样品溶液1 mL，分别加入无水葡萄糖1 mg，稀释至适宜浓度，使其测量范围在标准曲线之内。按多糖含量测定方法显色，根据安络小皮伞多糖含量与葡萄糖加入量，加样回收率（HR，%） 计算公式为：

式中：X1为测定的总量（mg·mL-1）；X2为样品原含量（mg·mL-1）；M为加入量（mg）。

3.2 多糖含量检测

3.2.1 标准曲线

标准曲线测量结果如表1所示。

由表1可知，标准曲线方程y=12.38x+0.014 4，R2=0.998 6，制作标准曲线如图1所示。

表1 苯酚-硫酸法葡萄糖标准曲线结果Tab.1 Result of standard curve of phenol-vitriol

由图1可知，葡萄糖在浓度范围内具有线性关系。

3.2.2 测试溶液稳定性考察

在510 nm波长下每隔30 min检测各个时间点的吸光度，其吸光度随时间变化如表2所示。

表2 稳定性试验结果Tab.2 Stability results

由表2可以看出，安络小皮伞多糖样品溶液吸光度在3 h内变化不明显，平均值为0.402，标准偏差为0.52%，RSD仅有1.280%，符合含量测定的要求，样品溶液稳定性良好。

3.2.3 测试溶液精密度考察

10份样品多糖含量测定结果见表3。

表3 精密度试验结果Tab.3 Precision of test results

有表3可知，平均含量值为4.072%，标准偏差为8.230%，RSD为2.020%，符合精密度要求。

3.2.4 加样回收率考察

根据计算公式得回收率测定结果如表4所示。

表4 回收率试验结果Tab.4 Recovery test results

由表4可知，平均回收率为97.84%，RSD为2.49%，基本符合加样回收率考察准确度要求。

4 麦角甾醇的定性检测

麦角甾醇又称麦角固醇，是由酵母及麦角菌（Claveceps）产生的。因其从谷类患麦角菌病而产生的物质中分离得到而得名，是维生素D的重要来源。甾醇类化合物有一定的抗炎镇痛作用。

麦角甾醇的定性检测利用其与碘化反应的生成物[4]，在紫外线照射下有绿色荧光的特点来进行检测。取安络小皮伞菌样品粉末10 g，加入甲醇100 mL萃取，静置24 h后加入浓度为5 mol·L-1的氢氧化钠100 mL和的无水乙醇30 mL进行皂化处理150 min，然后用水洗皂化液，加入石油醚或乙醚萃取可得萃取液。采用薄层色谱法显色，取少量萃取液滴在色谱板上，将碘加热升华至饱和状，取层析板凉干后放入反应40 s，观察层析板发现有褐色斑点产生，随后又消失，用长波紫外线照射可发现有斑点，证明萃取液中含有麦角甾醇物质。

5 小鼠醋酸扭体法镇痛试验

试验选用昆明小鼠10只，体重（22±3）g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，生产许可SCXK（沪） 2018-0006。对试验动物进行适应性喂养，正常饲养条件，自由进食进水，适应性喂养第3天腹腔注射0.8%的醋酸2 mL·100-1g-1，观察小鼠有无腹部收缩、臀部扭曲或后肢伸蹬现象，对无表现的小鼠视为异常不适宜试验动物，予以剔除，适应性喂养1周后进行分组试验，按雌雄随机分成2组，每组5只，试验组腹腔注射安络小皮伞菌样品溶液1 mL·100-1g-1，对照组腹腔注射生理盐水1 mL·100-1g-1，30 min后再给2组小鼠注射0.8%的醋酸2 mL·100-1g-1，记录小鼠20 min内扭体的次数，取各组平均值为扭体次数。

小鼠醋酸扭体法镇痛试验结果如表5所示。表5试验结果显示，试验组与对照组相比，20 min内扭体次数明显减少（P＜0.05），具有显著差异性，说明安络小皮伞菌样品溶液具有一定的镇痛效果。

表5 安络小皮伞菌样品对小鼠扭体试验的影响Tab.5 Effect of Marasmiellus adrosaceus on writhing test in mice

6 小鼠热板法镇痛试验

对上述小鼠适应性喂养第3天将热板仪温度调到55℃，将小鼠放置在垫板上，观察小鼠有无舔足或逃离现象，剔除无舔足和有逃离现象的表现异常小鼠，适应性喂养1周后进行选择雌性小鼠进行分组试验，随机分成2组，每组5只，试验组腹腔注射安络小皮伞菌样品溶液1 mL·100-1g-1，对照组腹腔注射生理盐水1 mL·100-1g-1，热板仪温度调到55℃，注射后15 min、30 min、45 min各记录1次小鼠痛反应阈值，小鼠痛反应阈值为小鼠放于热板上到受刺激有舔足反应的时间，如大于60 s按60 s记录，取各组平均值为小鼠痛反应阈值。小鼠热板法镇痛试验结果如表6所示。

表6 安络小皮伞菌样品对小鼠热板试验的影响Tab.6 Effect Effect of Marasmiellus adrosaceus sample on hot plate test in mice

由表6可知，试验组与对照组相比，小鼠痛反应阈值明显增加（P＜0.01），具有显著差异性，说明安络小皮伞菌样品溶液具有一定的镇痛活性。

7 结论

安络小皮伞内含的生物碱、多糖和麦角甾醇类物质，具有消炎、镇痛的效果[5]。在对安络小皮伞内含的镇痛物质定性和定量检测的基础上，通过小鼠醋酸扭体和热板镇痛试验表明，安络小皮伞中提取物中含有的镇痛物质，具有消除和缓解各种神经痛的作用，对小鼠的外部热刺激疼痛和体内化学刺激疼痛均有减轻或消除效果。