不同提取方法对竹荪多糖提取率及抗氧化性影响*

王荣琨，王 钦，罗 欣，孙达锋，蒋建新，朱莉伟**

（1.北京林业大学材料科学与技术学院，林业生物质材料与能源教育部工程研究中心，北京 100083；2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

竹荪 （Dictyophora indusiata） 是竹荪属 （Dictyophora)菌类的总称，是世界上名贵的大型食用菌之一，营养丰富，素有“真菌皇后”之美誉，主要分布在中国、英国、法国、日本、印度、斯里兰卡，古巴等国家以及北美洲地区[1]。竹荪含有多种微量元素和营养成分，其所含多糖是具有高活性的大分子物质，在降血压、血糖以及抗肿瘤、刺激免疫方面都有一定的疗效[2-3]。

多糖的提取是根据各种成分在不同介质的溶解性差异，利用多糖与提取溶剂的溶解度参数相近，相似相溶原理，对多糖类物质进行提取。一般多糖在植物体内不会单独存在，而是与蛋白质和核酸结合在一起，因此pH直接影响到多糖在溶剂中的溶解状态[4]。

在竹荪多糖的提取方面，目前国内外使用的方法有溶剂浸提法、超声波辅助提取法、微波提取法、酶解提取法等。Liu X等[5]通过响应面法（response surface methodology，RSM） 优化了竹荪子实体多糖的提取条件，得出最佳提取条件为提取时间2.1 h，料液比为1:37，提取温度92℃。在此条件下，竹荪子实体多糖的试验提取率为（15.95±0.144）%。巩贵丽[6]采用复合酶提取法，通过响应面法确定最佳提取工艺为复合酶浓度组合为果胶酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶浓度分别为1.5%、2.0%和2.0%，浸提时间、浸提温度和pH分别为105 min、52.5℃和5.25，此时所得竹荪多糖最大得率为 (9.77±0.18)%。黄庆斌[7]采用超声-微波联合提取工艺，确定超声功率520 W，微波功率150 W，料液比1:40为竹荪多糖提取最佳工艺参数，在此条件下竹荪多糖提取率为12.49%。近年来，膜分离技术、超高压提取技术、超临界萃取技术及离子交换技术等新兴的分离技术也逐渐应用于多糖提取领域。

抗氧化是真菌多糖的重要应用领域之一。与其他外源性抗氧化剂相比，真菌多糖具有低毒、副作用小、来源广等特点。然而，当前文献中甚少有关于压力辅助提取法对竹荪多糖提取的考察研究，更缺少该法下所得多糖的抗氧化活性的报道。本研究中测定了不同pH水浸提法、超声波辅助提取法及压力辅助提取法的竹荪多糖的提取率及抗氧化活性，并对多糖进行初步结构表征，以探究不同提取方法对多糖提取率及抗氧化性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

竹荪子实体由福建古田金唐食品有限公司提供，经55℃烘箱烘干24 h后粉碎，过40目筛，无水乙醇抽提脱色，气干后密封备用。

试剂：D-甘露糖、D-葡萄糖、半乳糖、木糖标准品，购自中国药品生物制品检定所；1，1-二苯基-2-苦基肼 （1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），购自阿拉丁化学试剂公司；氢氧化钠、盐酸等试剂均为分析纯，购自北京化工厂。

1.2 仪器与设备

L550台式低速离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；LGJ-12冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；UV-6100紫外可见分光光度计，上海比朗仪器有限公司；Bruker-ALPHA傅里叶变换红外光谱仪（FTIR），Bruker公司；BILON-1000CT型多用途恒温超声波提取机，上海比朗公司；318C+酶标仪，上海欧沛公司；GS-L型反应釜，威海嘉毅化工机械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 粗多糖提取

不同pH水浸提方法：称取3份备用的竹荪粉末各15.0 g，分别加入蒸馏水495.0 mL，其中2份蒸馏水分别用 1 mol·L-1HCl和 4 mol·L-1NaOH 溶液调节到pH为3和pH为9，3份浸泡液同时于95℃水浴振荡浸提3 h。

超声波辅助提取法：称取备用的竹荪粉末15.0 g，加入蒸馏水495.0 mL，于70℃、超声功率500 W下辅助提取30 min，再于95℃下水浴振荡浸提1 h。

压力辅助提取法：称取备用的竹荪粉末15.0 g，加入蒸馏水495.0 mL，放入高压反应釜中，于120℃、转速50 r·min-1下辅助提取1 h，再于95℃下水浴振荡浸提1 h。

以上提取方法所得浸提液离心后取上清液，浓缩后加入4倍体积无水乙醇，4℃过夜醇沉。沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，离心收集沉淀物，真空冷冻干燥后得粗多糖。粗多糖提取率（P1，%）计算公式为：

式中：m1表示所得粗多糖质量（g）；m2表示提取原料质量（g）。

1.3.2 粗多糖的纯化

将Sevage试剂[8]（氯仿:正丁醇=4:1）以1/3糖液体积的比例加入到2 mg·mL-1的粗多糖溶液中，振摇30 min，静置分层，取上层多糖溶液，重复多次后将多糖溶液浓缩装入透析袋（截留分子量8 000）中，自来水透析48 h，蒸馏水透析48 h，真空冷冻干燥后得纯化后的多糖。

1.3.3 单糖组成分析

多糖水解：取0.015 g的绝干样品，加入0.150 mL 72%硫酸，于30℃下进行水解、稀释，灭菌后进行冷却中和、离心，上清液使用0.220 μm微滤膜过滤[9]，滤液用离子交换色谱检测液体中的单糖含量。

色谱条件：离子交换色谱的检测色谱柱为Hamilton RCX-30-250/4.6（250.0 mm×4.6 mm）；淋洗液：A为150 mmol·L-1氢氧化钠；B为150 mmol·L-1氢氧化钠和500 mmol·L-1乙酸钠的混合溶液；流速0.700 mL·min-1；柱温 32℃；进样量 20 μL；检测方式：脉冲安培法。

单糖组成（P2，%）的计算公式为：

式中：C1为单糖的质量浓度（mg·mL-1）；C2为单糖总质量浓度（mg·mL-1）。

多糖纯度（P3，%）的计算公式为：

式中：C3为戊糖总质量浓度（mg·mL-1）；C4为己糖总质量浓度（mg·mL-1）；C5为多糖样品测试前的配置质量浓度（mg·mL-1）。

纯多糖提取率（P4，%） 的计算公式为：

式中：P1为粗多糖提取率 （%）；P3为多糖纯度 （%）。

1.3.4 多糖抗氧化性测试

清除DPPH自由基能力的测定：根据Xie[10]的方法测定竹荪粗多糖对DPPH自由基的清除能力，并以VC作阳性对照，每份样品平行操作3次，DPPH自由基的清除率（P5，%）计算公式为：

式中：A0为2 mL的DPPH自由基工作液与2 mL无水乙醇混合液的吸光度；A1为2 mL样品液与2 mL无水乙醇混合液的吸光度；A2为2 mL DPPH自由基工作液与2 mL样品液混合液的吸光度。

清除羟基自由基能力的测定：根据许小向等[11]的方法测定竹荪粗多糖对羟基自由基的清除能力，并以VC作阳性对照，每份样品平行操作3次，羟基自由基的清除率（P6，%） 计算公式为：

式中：A4为2 mL的FeSO4溶液+2 mL水杨酸-乙醇溶液+2 mL蒸馏水+2 mL H2O2溶液的混合液的吸光度；A3为2 mL FeSO4溶液+2 mL水杨酸-乙醇溶液+2 mL样品液+2 mL H2O2溶液的混合液的吸光度；AS为2 mL的FeSO4溶液+2 mL样品液+2 mL蒸馏水+2 mL的H2O2溶液的混合液的吸光度。

1.3.5 紫外光谱和红外光谱分析

将纯化后的竹荪多糖配制成浓度为0.5 mg·mL-1糖溶液，以蒸馏水作为对照，在190 nm～900 nm范围内进行紫外吸收光谱扫描。

取5 mg纯化多糖样品，与500 mg的KBr混匀研磨、压片，在400 cm-1～4 000 cm-1范围内进行红外光谱扫描。

2 结果与讨论

2.1 不同提取方法对竹荪多糖提取率的影响

不同提取方法对竹荪多糖提取率的影响见图1。

从图1可以看出，水浸提法采用了3种不同的pH条件，但不同的pH条件无论对竹荪粗多糖提取率、粗多糖纯度还是纯多糖提取率，影响均不显著，相比较而言pH为9时粗多糖纯度和纯多糖提取率均略高于其他pH条件水提法。刘浩等[12]在蕲山药多糖提取中也得到了类似的结果，在所探究的水浸提工艺因素中，pH影响并不显著。考虑到工艺简单的需求，采用水浸提法提取竹荪多糖时选用pH自然较好。

当采用超声波辅助提取法时，粗多糖提取率、粗多糖纯度和纯多糖提取率均显著高于水浸提法，其中纯多糖提取率最大，达到了竹荪原料质量的12.28%。在压力辅助提取法中，粗多糖提取率低，但粗多糖纯度为各提取工艺之最，高达81.46%，且纯多糖提取率介于水浸提法和超声波辅助提取法二者之间。可见在压力辅助条件下，多糖提取所需时间较水浸提法短，所得多糖纯度高，这在多糖提取工艺中具有一定应用价值。

超声波辅助提取法和压力辅助提取法均优于水浸提法，所得竹荪纯多糖的提取率都有不同程度的提高。这是利用了超声波的机械效应、空化效应及高温的热效应原理，能快速、有效地破碎生物细胞和组织，加快多糖的溶出。比较超声波辅助提取法与压力辅助提取法，可以看出超声波辅助提取法所得多糖的粗多糖和纯多糖提取率均明显高于压力辅助提取法，但粗多糖纯度略低，推测是由于超声波的空化作用虽有利于原料中多糖的扩散，但同时也有利于杂质的扩散，所以降低了粗多糖纯度。而压力条件一方面有利于提高多糖的溶解度，但同时也会造成糖苷键的断裂，促使多糖水解成单糖，因此粗多糖和纯多糖提取率比水浸提法和超声波辅助提取法都偏低。

2.2 不同提取方法对竹荪多糖抗氧化性的影响

DPPH自由基在有机溶剂中是一种呈紫色的稳定自由基，与具有抗氧化性的样品接触后，可通过DPPH自由基褪色明显程度来检测样品对DPPH自由基的清除效果。不同提取方法对竹荪多糖对DPPH自由基清除率的影响结果见图2。

由图2可以看出，VC对DPPH自由基的清除率较好，不同提取方法的竹荪多糖对DPPH自由基的清除率均随质量浓度的增加而上升，但都没有VC效果好。不同提取方法中，超声波辅助提取的多糖对DPPH自由基的清除能力最强，在竹荪多糖浓度为2 mg·mL-1时可达到60.69%。

不同提取方法的竹荪多糖对羟基自由基的清除率的影响见图3。

由图3可以看出，不同提取方法的竹荪多糖对羟基自由基的清除率均随质量浓度的增加而上升，但都没有VC效果好。不同提取方法中，超声波辅助提取的多糖对于羟基自由基的清除能力同样也是最强的，在竹荪粗多糖浓度为2 mg·mL-1时可以达到46.53%。

从竹荪多糖对DPPH自由基和羟基自由基的清除率对比可以看出，不同提取方法对竹荪多糖抗氧化活性影响较明显，其中超声波辅助提取法所得多糖抗氧化性最强。这可能是由于超声波使部分竹荪多糖的主链和支链断裂，会降低多糖的分子量，改变多糖中各种单糖比例，从而使多糖的抗氧化性发生改变[16]。

2.3 不同提取方法的竹荪多糖中单糖组成对比

结合不同提取方法对竹荪多糖提取率及抗氧化性的影响，从简化工艺、节约成本的角度出发，选取了pH自然水浸提法和超声波辅助提取法的纯化竹荪多糖进行了水解，测定比较了两者的单糖组成，结果见图4。

由图4可知，不同提取方法提取的竹荪多糖均由半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖4种单糖组成，这与连宾等[13]的研究结果一致。超声波辅助提取法所得的竹荪纯化多糖中，木糖的含量明显少于pH自然水浸提法所得的竹荪纯化多糖。分析可能是由于木糖的不稳定性造成的，超声波断开了多糖中木糖的糖苷键，使得一些木糖成为单糖溶解在提取液中，醇沉时无法被沉淀出来。

2.4 紫外可见光谱和红外光谱分析

自然pH水浸提法和超声波辅助提取法的竹荪纯化多糖在260 nm～280 nm附近没有明显吸收峰，说明纯化后的竹荪多糖不含核酸和蛋白质。2种竹荪纯化多糖的红外吸收谱见图5。

由图5可知，两者的特征吸收峰并无明显差异。2种多糖均在3 411 cm-1有强吸收峰，是羟基的伸缩振动引起的，由于分子内羟基间形成氢键使吸收峰变宽；在2 927 cm-1的吸收峰是亚甲基的C-H伸缩振动所引起的，为多糖物质的特征吸收峰[8]。在1 651 cm-1的吸收峰可能是羰基的非伸缩振动所引起的；在1 373 cm-1出现的特征吸收峰，说明含有羰基对称伸缩振动；1 041 cm-1的强吸收峰推测是由吡喃环上的C-O-C环内醚C-O的伸缩振动和C-O-H中的O-H变角振动引起，890 cm-1是β-吡喃糖苷键的吸收峰，说明竹荪纯化多糖含有吡喃糖，并且以β-糖苷键为主要连接方式[14-15]。

3 结论

对比不同提取方法的竹荪多糖提取率，并分别对pH自然水浸提法和超声波辅助提取法所得多糖进行单糖组成分析、DPPH自由基与羟基自由基的清除率测定、紫外光谱和红外光谱分析。

超声波辅助提取、压力辅助提取和不同pH水浸提法所得的纯多糖提取率依次为12.28%、7.02%和6.61%～6.81%，并且pH对水浸提效果并无显著影响；超声波辅助提取法和压力辅助提取法的竹荪纯多糖提取率均高于水浸提法，且用时更短。

不同提取方法所提取的竹荪粗多糖，对多种自由基的清除能力均具有浓度依赖性，其抗氧化活性受提取方法影响较明显，其中超声波辅助提取法所得多糖抗氧化性最强，对羟基自由基和DPPH自由基的清除率在浓度2 mg·mL-1时分别可达46.53%和60.69%。竹荪多糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和木糖组成。

超声波辅助提取法和压力辅助提取法所得竹荪粗多糖纯度和抗氧化活性均优于传统的水浸提法，推测是由于这两种辅助条件破坏了多糖与蛋白等杂质的链接键，并使多糖结构中更多的活性基团暴露出来，从而提升了粗多糖的纯度和抗氧化能力。由此可见，压力辅助提取法在多糖提取工艺中具有一定的应用价值，超声波辅助提取法的效果最优。