马尔堡病毒GP蛋白C肽的抑制活性及作用机理研究

陈文文，郑文铝，余硕，花晨，戴秋云

1.军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071；2.复旦大学 基础医学院，上海 200433

马尔堡病毒（Marburg virus，MARV）属丝状病毒属，为单股负链非节段RNA 病毒，在电镜下呈细丝状，为烈性传染病马尔堡出血热的病原体。自1967 年发现以来，在非洲多地曾多次暴发，累计出现460 多个感染病例，已造成380 多人死亡，病死率超过80%[1-2]，最近的一次马尔堡出血热疫情发生在2017 年的乌干达，导致3 人死亡[3]。马尔堡病毒基因组约19 kb，由7 个独立的开放读框（ORF）组成，共编码7 个蛋白[4-5]，分别为核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP）、包膜糖蛋白（glyco⁃protein，GP）、基质蛋白（matrix protein）VP40，以及非结构蛋白VP24、VP30、VP35 和病毒聚合酶L（polymerase L），其中GP 是介导病毒进入宿主细胞的关键蛋白，也是疫苗及中和抗体的抗原或靶标[6-10]。一般认为，GP 亚单位GP1 负责细胞附着，GP2 催化 膜融 合[4]。 GP2 包 含 2 个 七肽重 复区，N端和C 端（分别为NHR 和CHR）在融合过程中采用六螺旋束结构，这种结构为病毒和细胞膜融合提供了热力学驱动力[11]。MARV 与埃博拉病毒（EBOV）同属丝状病毒，且二者的GP2 具有60%的序列同源性，总体结构相似，病毒进入机制可能类似[11-13]。目前，已发现来自 EBOV 的 CHR 的 C 肽具有较好的进入抑制活性，如GP610、1-chol、Tat-Ebo[14-17]，但 MARV 的 CHR 的 C 肽抑制活性未见报道，作用机制也不清楚。我们合成了来自MARV的CHR 区域的C 肽MP 及突变体，利用pVAX1-MGP 与pNL-4.3-Luc-R-E-质粒包装假病毒体系，测定各肽对假病毒融合的抑制活性；利用圆二色谱、凝胶色谱分析C 肽及其突变体对MARV 的N肽的相互作用，发现MARV 的C 肽与N 肽相互作用较弱，导致C 肽的抗病毒活性较弱，但C 肽改造后可提高活性。

1 材料和方法

1.1 材料

BHK21-WI2、293T 细胞，pVAX1-MGP 质粒由本实验室保存；pNL-4.3-Luc-R-E-质粒由中国医学科学院病原生物学研究所种辉辉老师馈赠；Li⁃pofectAMINE 2000 购 自 Invitrogen 公 司 ；96 孔细 胞培养板、DMEM、胎牛血清购自Thermo Fisher Sci⁃entific 公司；细胞裂解液、萤光素酶报告试剂盒购自Promega 公司；Rink 树脂购自天津南开公司；1-羟基苯并三唑（HOBT）、苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、Fmoc 保护氨基酸等购自上海吉尔生化有限公司；哌啶、二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷、无水甲醇、无水乙醚等购自国药集团；三氟乙酸（TFA）、二异丙基二乙胺（DIEA）等购自北京伊诺凯有限公司。

多肽固相合成仪（德国Zinsser analytic 公司）；旋转蒸发仪（日本Eyela 公司）；冻干机（德国Christ 公司）；安捷伦1200 型高效液相色谱仪（美国 Agilent Technologies 公司）；Waters 1525 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；多功能酶标仪（美国 PE 公司）；microTOF QII 质谱仪（德国 Bruker 公司）；Chirascan plus 圆二色光谱仪（英国Applied Photophysics Ltd 公司）。

1.2 多肽合成

C 肽（MP）来 源 于 MARV GP 的 CHR 区 域（611～637 残基），MP-1 为 MP 的 N 端增加一个亮氨酸的C 肽突变体，以增加疏水相互作用；MP-2～MP-5 分别为 MP-1 的 b、f、c、g 位增加电荷相互作用氨基酸，以稳定分子的α螺旋结构，同时增加C 肽与 N 肽作用的电荷相互作用；MP-6～MP-9 分别为MP 突变体N 端增加来自抗HIV 融合多肽的部分螺旋链（WEEILKK、WMEWDRE）[18]的突变体；MP-10 的 MT 也来自抗 HIV 融 合 多 肽[19-20]，期望增加与N 肽的相互作用。

MGP 的N 肽（MGP-N）粗品由中科亚光公司合成，其余多肽采用本实验室的Zinsser analytic多肽合成仪合成[21-22]。合成的0.06 mol 肽-树脂用裂解液（TFA∶DTT∶H2O∶TIS=4.4 mL∶0.25 g∶0.25 mL∶0.1 mL）裂解，室温搅拌 3 h 脱去保护基，旋转蒸发除去大部分TFA，加入提前冷却的无水乙醚，4℃静置半小时，抽滤得粗肽。粗肽经HPLC 纯化，纯化柱为 Kromasil-C18 柱（100 Å，10 μm，10 mm×250 mm），0.1%三氟乙酸的水及乙腈梯度洗脱，冻干得纯肽干粉。纯化后的多肽经分析型HPLC 分析［色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）。梯度：0～1 min，5% ～10% B；1～25 min，10% ～50% B。 A 为 含0.1% TFA 的水，B 为含 0.1% TFA 的乙腈，流速 1 mL/min，波长214 nm］，最后用质谱仪测定多肽的相对分子质量。

1.3 假病毒的制备

参考实验室之前研究的马尔堡假病毒包装策略[23]，转染前1 h 用Opti-DMEM 培养基处理细胞，pVAX1-MGP 与 pNL4-3.Luc.R-E-质粒按 1∶2 的比例共转染293T 细胞，72 h 后收获上清，添加FBS 至20%，0.2 μm 滤膜过滤，-80℃冻存备用。

1.4 抑制剂活性测定

假病毒与不同浓度的抑制剂等体积混合，各50 μL/孔加入96 孔板中，阴性对照组加入等体积的H2O，37℃孵育30 min 备用。胰酶消化BHK21-WI2 细胞，用含2% FBS 的培养基重悬细胞至2×105/mL，向孵育后的96 孔板中每孔加入50 μL 细胞稀释液，48 h 后裂解细胞，检测相对发光值RLU，计算假病毒抑制率，用GraphPad-Prism 5 软件计算各抑制剂的半数抑制浓度（IC50）值。

1.5 圆二色谱测定

用0.01 mol/L 的磷酸缓冲液（pH7.2）配制各多肽溶液及N 肽与各C 肽、突变体的混合物溶液（终浓度均为35 μmol/L）。圆二色谱在室温下测定，λ=190～260 nm，d=1 mm，空白对照为 0.01 mol/L 磷酸缓冲液，重复3 次取平均值并计算摩尔椭圆度。实验数据用Origin 软件进行绘图及处理，用下式计算各多肽的α螺旋含量[24-25]：

α螺旋含量=（-[θ]222-2340）/30300

1.6 凝胶色谱排阻法测定MGP-N与C肽及突变体的相互作用

MGP-N、C 肽及C 肽突变体分别用磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH7.2）稀释至 0.2 mmo/L，各取30 μL 上样，流速 0.8 mL/min，检测波长214 nm，色谱柱为 TSK-G2000SWxl 柱（日本 Tosoh Biosci⁃ence LLC 公司）。C 肽、突变体与 MGP-N 复合物的高压凝胶色谱条件同上，但等体积的MGP-N 与C 肽、突变体混合后，37℃水浴中孵育30 min 后上样（60 μL）。

2 结果

2.1 多肽的纯化及鉴定

各多肽（表1）纯度大于95%，部分多肽的HPLC 分析图及质谱检测结果见图1、2，相对分子质量测定结果与理论计算一致。

2.2 C肽及突变体的抑制活性

各抑制剂IC50见图3、表1。结果显示，MARV的GP 蛋白C 肽对MARV 有一定的抑制活性，但抑制活性较差（IC50=32.67 μmol/L），其突变体活性IC50=9.61～33.47 μmol/L，其中 MP-4 的活性最高。抑制剂 MP-8 浓度≥20 μmol/L 时，显著影响细胞正常生长，细胞毒性较高，未进行后续活性检测。

表1 MARV的C肽氨基酸序列及抑制活性

2.3 C肽、N肽及混合物的圆二色谱

典型多肽及混合肽圆二色谱结果见图4，α螺旋含量计算结果见表 2。除 MP-6～MP-8 外，C 肽及 N 肽本身的α 螺旋含量低（0.30%～6.85%）（表2），在N 端增加螺旋链后（MP-6～MP-8），α螺旋含量提高（33.66%～69.77%），显著高于其他C 肽。N肽与C 肽混合后形成了典型的α螺旋结构，MP、MP-1～MP-5 及 MP-9～MP-10 与 N 肽混合后α螺旋显著增加（16.23%～29.23%）,但 MP-6～MP-8 与MGP-N 混合后α螺旋含量变化不大。

图1 部分多肽的HPLC 分析图

图2 部分多肽的质谱图

图3 部分多肽的IC50 结果

图4 N 肽、C 肽及其复合物的圆二色谱

2.4 N肽、C肽及混合物的凝胶排阻色谱

部分多肽及复合物的凝胶排阻色谱结果见图5。N 肽与MP-6、MP-7 的出峰时间明显早于其他肽，且N 肽峰高很低，显示上述多肽可能形成了聚合体。N 肽与 MP、MP-1～MP-4、MP-9～MP-10 复合物凝胶排阻色谱结果类似（图未列出），没有出现明显的多肽与MGP-N 复合物洗脱峰，但N肽与MP-5、MP-6 混合后出现了新的洗脱峰，说明有部分复合物的形成。

3 讨论

MP 的抑制活性较弱（IC50=32.67 μmol/L），通过增加 b、f、c、g 位的电荷相互作用可以提高 C 肽的活性，如 MP-4 的抑制活性（IC50=9.61 μmol/L）为MP、MP-1（IC50分别为32.67、33.47 μmol/L）的3倍多。然而，C 肽或复合物的α螺旋含量提高与活性的增加并无对应关系，如MP-6 的α螺旋含量较MP-4 有显著提高，但抑制活性（IC50=15.82 μmol/L）低于MP-4。

表2 多肽及混合物α螺旋含量

图5 多肽及其复合物凝胶排阻色谱

凝胶排阻色谱结果显示，MP-6 及MP-7 自身也发生了聚集，可能与其N 端引入的螺旋序列有关。MP-5、MP-6 与N 肽混合后形成的新峰并未最先出峰，说明其多聚体并不大。N 肽的自聚集作用且α螺旋率低，可能影响了其与C 肽形成六束α螺旋，导致C 肽的抗病毒活性较低。

此外，在抑制剂活性检测过程中，抑制剂浓度大于70 μmol/L 时，显著影响细胞正常生长，48 h 后检测，RLU 值远大于阳性对照组，可能是高浓度的抑制剂破坏了细胞膜的完整性，导致病毒更易进入细胞。

总之，马尔堡病毒包膜糖蛋白的C 肽抗病毒活性较弱，C 肽与N 肽相互作用较弱，C 肽改造后活性提高。本工作可为马尔堡病毒抑制剂的设计提供参考。