沙眼衣原体CT135蛋白的表达与抗体制备

孙志会，罗声栋，何泽民，胡燕，宋立华，王景林

1.病原微生物生物安全国家重点实验室，军事科学院 军事医学研究院 微生物流行病研究所，北京 100071；2.解放军总医院第五医学中心 临床研究管理中心，北京 100039

衣原体是专性胞内寄生的革兰阴性菌，具有特殊的双相发育周期：有传染性但无代谢活性的原体（EB）进入宿主细胞，并在其中分化为具有代谢活性的网状体（RB）。沙眼衣原体有15 个血清型，血清型A～C 是导致沙眼和可预防性失明的主要原因；血清型D～K 主要引起泌尿生殖道的急性和慢性炎症性疾病，可导致不孕或异位妊娠[1]。沙眼衣原体是性病性淋巴肉芽肿（LGV）的病原体，会引起腹股沟淋巴结[2]。沙眼衣原体感染多为隐性感染，不及时治疗极易引起反复感染，大大提高宫颈癌发病率和HIV 的感染风险[3]，同时引起盆腔炎、子宫内膜炎、输卵管炎和尿道炎等多种并发症[4-5]。

研究表明沙眼衣原体的毒力与衣原体质粒[6]和染色体CT135 基因[7]等多个毒力因子有关[8]。在小鼠感染模型中，质粒和CT135 基因分别与沙眼衣原体感染的菌体载量和慢性感染相关[9]。CT135 基因编码一个有4 个跨膜结构域的假定的包涵体膜蛋白[10]，其功能未知，目前此蛋白在衣原体中的表达尚缺乏报道。本研究以pET-32a（+）为载体，构建出C 端带有His 标签的重组质粒表达CT135 蛋白并制备抗血清，用于建立CT135 蛋白免疫检测方法。

1 材料和方法

1.1 材料

沙眼衣原体 L2（434）、载体 pET-32a（+）由本实验保存；大肠杆菌Trans1-T1 感受态、BL21（DE3）购自北京全式金公司；高保真DNA 聚合酶、PCR 产物纯化试剂盒，DNA 提取试剂盒、一抗（Anti-His 抗体）购自北京全式金公司；二抗［680RD 羊抗鼠 IgG（H+L）］购自 LI-COR 公司；限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ，T4DNA 连接酶购自NEB 公司；Precast-Glgel 变性预制胶购自上海生工生物科技有限公司；蛋白纯化Ni2＋-NTA 亲和层析柱购自Clontech 公司；引物由北京博迈德生物技术有限公司合成；PEQSTAR 2× PCR 仪为peQLab公司产品；Odyssey 双色红外扫描仪为LI-COR 公司产品。

1.2 引物设计与合成

设计引物对（表1）。以沙眼衣原体L2（434）基因组为模板，用引物对CT135-F/CT135-R 和高保真DNA 聚合酶扩增CT135 基因片段（全长1083 bp）（扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，57℃退火，72℃延伸 1 min，28 个循环；72℃终延伸 5 min）。以 pET-32a（+）质粒为模板，用引物对pET32a-F/pET32a-R 和高保真DNA 聚合酶扩增pET-32a（+）载体（扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性 30 s，57℃退火，72℃延伸 3 min 30 s，28 个循环；72℃终延伸 5 min）。

1.3 CT135全长重组质粒构建

用1%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，正确大小的PCR 产物用纯化试剂盒纯化。用限制性内切酶NdeⅠ/XhoⅠ分别对目的片段和载体片段进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4DNA 连接酶16℃过夜连接，转化大肠杆菌T1 感受态，涂板后37℃过夜培养，挑单克隆并用引物对28a5F/28a3R鉴定正确后送博迈德公司测序。测序正确即得到重组质粒pET-32a-CT135-His（以下简称WT）。

表1 重组质粒构建及鉴定的引物

1.4 CT135基因截短重组质粒构建

以WT 为模板，分别用引物对MT1-F/32aR1、MT2-F/32aR1、MT3-F/32aR1、pET32a-F/MT4-R、pET32a-F/MT5-R、pET32a-F/MT6-R 和 高 保 真DNA 聚合酶扩增CT135 N 端逐渐缩短和C 端逐渐缩短的6 个不同的截短重组质粒片段，用限制性内切酶NdeⅠ单酶切，切胶纯化后用T4DNA 连接酶连接构建截短重组质粒，分别命名为MT1、MT2、MT3、MT4、MT5、MT6。

1.5 蛋白表达

1.5.1 蛋白取样 将测序正确的7 个重组质粒分别转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态，取100 μL转化质粒的感受态涂到含50 μg/mL 氨苄青霉素的平板上，12～14 h 后挑菌于小试管中过夜培养14 h，按 1∶100 的比例转接到 100 mL 含 50 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 液中，37℃、200 r/min 摇床培养至D600nm为 0.8，取样 1 mL 后加入 0.6 mmol/L IPTG 继续培养，之后分别在 0.5、1、2、3、4、5 h 各取样1 mL。

1.5.2 SDS-PAGE 取样完成后室温12 000 r/min 离心 2 min，去上清；加 100 μL PBS 重悬，后加20 μL 6×上样缓冲液，沸水浴10 min，冰水浴1 min；室温5000 r/min 离心1 min；预制胶每个泳道加样 20 μL，120 V 50 min 蛋白电泳，每个重组质粒的蛋白样品进行2 次SDS-PAGE。

1.5.3 考马斯亮蓝染色和Western 印迹 电泳结束后，一块预制胶用于考马斯亮蓝染色。另一块预制胶经 80 V、45 min 转至 PVDF 膜，脱脂奶粉室温孵育 2 h，PBS 洗 3 次，每次 5 min；以 1∶1000的比例加入一抗（Anti-His），4℃过夜孵育14 h，PBST 洗 5 次，每次 5 min；以 1∶10 000 的比例加入二抗，常温避光孵育1 h，PBST 洗5 次，每次5 min；经Odyssey 双色红外成像系统检测信号。

1.6 抗体制备及检测

本研究选择MT6 蛋白表达纯化并注射BALB/c 小鼠制备小鼠多抗。将转化有MT6 重组质粒的大肠杆菌接种到100 mL LB 液中，经37℃、200 r/min 摇床培养至D600nm为 0.8 时加 IPTG（浓度同上），诱导4 h 后取菌液离心沉淀超声波破碎，经Ni2+-NTA 亲和层析柱纯化，用40 mmol/L 咪唑去除杂蛋白，300 mmol/L 咪唑洗脱目的蛋白。

取50 μg 纯化的重组MT6 蛋白，与弗式完全佐剂按1∶1 的体积比完全乳化后皮下注射小鼠，2周后取25 μg 纯化的MT6 蛋白与弗式不完全佐剂按1∶1 的体积比完全乳化后进行二次免疫，2 周后以同样的方法进行第三次免疫，1 周后小鼠尾静脉取血，室温静置30 min，4℃放置30 min，5000 r/min 室温离心5 min，收集上层血清。将此血清为一抗、羊抗鼠抗体为二抗进行Western 印迹，经Odyssey 双色红外成像系统检测信号。

2 结果

2.1 质粒构建

以pET-32a（+）质粒为骨架连接CT135 基因，构建重组质粒 WT、MT1～MT6（图1）。WT 是有CT135 全长基因的重组质粒（图1A）；MT1～MT3 是CT135 蛋白N 端逐渐缩短的重组质粒，MT4～MT6是CT135 蛋白C 端逐渐缩短的重组质粒（图1B）。

2.2 蛋白表达

图1 重组质粒示意图（A）及各片段电泳图（B）

考马斯亮蓝染色结果显示，MT6 蛋白相对分子质量约为14×103，与实际大小符合；而WT 和MT1～MT5 均观察不到重组蛋白（图2A），结果提示CT135 蛋白在大肠杆菌中表达量低，不利于大量纯化制备抗体。Western 印迹显示所有质粒均可表达重组蛋白（图2B），WT 蛋白相对分子质量约为40×103，与实际相符，且蛋白表达量随时间先增加后减少，4～5 h 后表达量接近本底水平，提示CT135 蛋白表达量低且不稳定。而MT1～MT6 截短突变体的小蛋白表达量随时间出现不同的变化趋势。其中 MT1、MT2、MT4 和 MT5 结果类似，蛋白表达量随诱导时间增加几乎不变；MT3 和MT6 蛋白表达量随时间增加而增加，二者不同的是后者的表达量远远高于前者，可进行蛋白的大量纯化，用于抗体制备。

2.3 多克隆抗体制备及检测

在所有的重组质粒中只有MT6 可以高表达重组蛋白，所以本研究选择其进行小鼠抗血清的制备。分别取WT 和MT6 蛋白表达0～5 h 的菌液样品，以实验制备的小鼠多克隆抗体为一抗，结果检测到蛋白大小条带分别为40×103和14×103（图3），与 WT 和 MT6 蛋白大小一致。

3 讨论

沙眼衣原体CT135 是在衣原体发育周期的早期表达的质粒独立调控染色体基因[11]。研究表明沙眼衣原体毒力因子CT135 在体内稳定，在体外呈多态性，体外培养过程中CT135 基因发生缺失突变，且此突变减弱沙眼衣原体血清型D 在雌性小鼠生殖道中的毒力[12]。

CT135 基因编码重要的毒力因子[6-8]。本研究以 pET32a（+）质粒为载体，构建 WT 和 MT1～MT6等7 个不同长度的CT135 基因重组质粒，建立了CT135 重组表达方法，为后续探究CT135 蛋白的功能打下了基础。在大肠杆菌中，随着诱导时间的延长，CT135 表达量先增加后减少，提示重组CT135 蛋白发生了降解，纯化表达CT135 全长蛋白是急需解决的难题。另外，多个CT135 截短突变体的蛋白表达量也很低，推测这些区域仍对大肠杆菌有一定的毒性。尽管全长CT135 表达困难，但本研究成功制备了小鼠抗CT135 蛋白N 端的抗血清，为后期检测衣原体中CT135 的表达奠定了基础。

图2 蛋白表达结果

图3 抗血清检测