绿原酸对人骨肉瘤MG63细胞生物学行为的影响

何家恒，张雨，刘波，施勤，罗宗平

1.苏州大学 附属第一医院骨科，江苏 苏州 215006；2.苏州大学 骨科研究所，江苏 苏州 215006

骨肉瘤是好发于儿童和青少年的恶性肿瘤[1]， 起源于间质细胞系，是骨恶性肿瘤中最多见的一种。肿瘤迅速生长引起全身免疫反应的减弱，临床主要表现为避痛性跛行、关节活动受限和肌肉萎缩等症状，死亡率较高。对骨肉瘤治疗的研究是全球关注的焦点。目前临床骨肉瘤治疗以手术治疗为主[2]，通过切除病变部位并结合放化疗达到根治病变的目的,但是患者将承受巨大的手术风险，并有可能造成严重的家庭及社会经济负担。因此，寻找一种能够缓解甚至治愈骨肉瘤的药物对于改善骨肉瘤患者的预后具有重大意义。

多酚类物质近年来被研究者广泛关注，研究表明其有着抗菌、抗氧化、抗骨质疏松[3]以及抗肿瘤的作用。在本实验中，我们探讨了多酚类物质绿原酸[4]对骨肉瘤细胞MG63 的增殖、肿瘤细胞干性、侵袭、迁移及凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

人骨肉瘤细胞株MG63（苏州大学附属第一医院惠赠）；高糖培养基、胰蛋白酶（Gibco 公司）；胎牛血清（Hyclone 公司）；TRIzol 总 RNA 提取液、CCK-8 试剂盒、结晶紫染色剂（碧云天公司）；绿原酸（Sigma Aldrich 公司）；Transwell 小室（Corning公司）；Annexin-V FITC 凋亡试剂盒（BD Pharmin⁃geen 公司）；倒置显微镜（上海蔡康光学仪器厂）；CO2培养箱、台式离心机、全波长酶标仪（Thermo公司）；流式细胞仪（Millipore 公司）；荧光定量PCR 仪（Bio-Rad 公司）。

1.2 细胞培养方法

将人骨肉瘤细胞株MG63 接种于细胞培养板，用含10%胎牛血清的高糖培养基在37℃、5%CO2、95%湿度条件下培养，采用0.25%的胰酶进行细胞传代，倒置显微镜实时观察细胞形态，当达到所需细胞数时进行实验。

1.3 细胞增殖检测

用CCK-8 试剂盒检测MG63 细胞的增殖。CCK-8 试剂盒中的WST-8 试剂可以被细胞线粒体内的脱氢酶还原生成橙黄色甲臜，细胞数目越多则颜色越深。在HDMEM 细胞培养基中按10%比例加入CCK-8 溶液混匀后，每孔均匀加入等量上述溶液（96 孔板），37℃培养箱中孵育2 h，转移反应后的液体至新的培养板中。用全波长酶标仪测定D450nm值，D450nm值与细胞数量呈正相关。

1.4 细胞侵袭实验

将对照组及干预后的细胞用含2%胎牛血清的培养基重悬，计数，所需细胞密度为5×105/mL。每块 24 孔板的 Transwell 上室只加入 100 μL 细胞悬液，下室加入800 μL 含10%胎牛血清的培养基，放入培养箱培养24 h 后取出Transwell 小室，吸去小室中的培养液，用棉签轻轻擦去小室上层未迁移的细胞。用PBS 清洗3 次，用4%多聚甲醛室温固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，用PBS 清洗后在显微镜10 倍和40 倍物镜下观察，用ImageJ 软件分析每张照片迁移的细胞数。

1.5 划痕实验

用含10%胎牛血清的培养基重悬细胞，接种至6 孔培养板中，待细胞长满。6 孔培养板底预先用黑笔划3 条横线，用200 μL 的枪头垂直于孔板划3 条竖线，使其与底部3 条横线相互垂直。用PBS 洗涤被刮下的细胞，加入培养基，显微镜下观察并拍照。选择0、12、24 h 为拍摄时间点，观察细胞的迁移面积。

1.6 RT-PCR

用TRIzol 总RNA 提取液提取对照组和实验组MG63 细胞的总RNA，测定浓度，将1 μg RNA逆转录为cDNA，在PCR 板上加样扩增，依据公式2-ΔΔCt计算目的基因相对于对照组的表达量［ΔΔCt=（Ct 靶基因-Ct 内参）实验组-（Ct 靶基因-Ct内参）对照组］。实验使用的引物序列见表1。

1.7 细胞凋亡检测

收集培养皿内培养基，PBS 清洗细胞后用0.25%胰蛋白酶消化贴壁的细胞，1500 r/min 离心5 min，弃上清后用PBS 洗涤细胞后离心。用凋亡试剂盒缓冲液重悬细胞，每管加入5 μL Annex⁃in-V FITC 及碘化丙啶（PI）染液10 μL，室温避光孵育20 min，用流式细胞仪检测样品。

表1 引物序列

1.8 数据分析

所有数据以x±s表示，应用 SPSS13.0 软件进行数据分析，2 组间比较采用独立样本t检验，全部统计检验均为双侧概率检验，检验水准α=0.05，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 绿原酸抑制MG63细胞增殖

用CCK-8 试剂盒检测细胞的增殖，结果显示和正常条件生长的细胞相比，绿原酸干预后的第3 d 开始细胞增殖显著降低（P＜0.05，图1）。

2.2 绿原酸抑制肿瘤干性相关基因的表达

实验所用的MG63 骨肉瘤细胞的干细胞的标志物包括Sox2 及核干细胞因子（Nucleostemin）基因。MG63 骨肉瘤细胞经绿原酸处理5 d 后进行基因检测，处理组细胞的肿瘤干性基因较正常生长细胞均有不同程度的降低（P＜0.05）（图2），表明绿原酸处理抑制了MG63 肿瘤干细胞相关基因的表达。

2.3 绿原酸抑制MG63细胞侵袭及迁移

图1 绿原酸对MG63 细胞增殖的影响

图2 绿原酸对MG63 细胞肿瘤干性基因Sox2 及 Nucleostemin 表达的影响

用Transwell 培养板模拟肿瘤细胞侵袭，比较Transwell 孔的上下室内细胞数量及细胞的迁移能力。细胞划痕实验是检测细胞迁移能力的一种方式，主要通过在培养皿上种植的细胞中划出一道宽度相同的空隙，来模拟细胞在体外迁移的过程，通过比较空隙恢复情况来确定细胞的迁移速率。Transwell 结果（图3）显示，实验组侵袭到下室的细胞数量明显减少（P＜0.05），表明绿原酸抑制了MG63 细胞的侵袭性。划痕实验（图4）中正常生长细胞的“伤口”已基本愈合，然而在绿原酸的作用下MG63 细胞还留有较大空隙，说明绿原酸抑制了骨肉瘤MG63 细胞的迁移性。

2.4 绿原酸下调抗凋亡基因Bcl-2表达，促进MG63细胞的凋亡

图3 Transwell 细胞侵袭实验检测绿原酸对MG63 细胞侵袭性的影响

图4 细胞划痕实验检测绿原酸对MG63 细胞迁移性的影响

绿原酸干预 MG63 细胞 3 d 后，Bcl-2 的表达量减少（P＜0.05），而Bax 的表达则无明显统计学差异（P＞0.05）（图5）。用 PI 染色细胞核酸，PI 不可透过细胞膜，根据染色情况可判断膜的完整性，区分坏死细胞、凋亡细胞和活细胞。PI 和An⁃nexin-V 联合可以分辨活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。图6 的Q3 区域为凋亡细胞阳性区域，此结果表明绿原酸处理后的细胞凋亡比例更高（P＜0.05）。

3 讨论

骨肉瘤是起源于间充质细胞的具有高度侵袭性的恶性肿瘤，其特征为增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织。目前针对骨肉瘤的治疗方法大多以手术根治性治疗联合药物化疗为主，但药物化疗副作用明显，且肿瘤细胞易对化疗药物产生耐药[5]，严重影响了患者的生活质量，限制了患者的预后生存，因此寻找毒副作用小且不易产生耐药的物质用于治疗骨肉瘤，对于临床上改善患者预后具有重大意义。本实验中所用的绿原酸是从植物体内提取的多酚类物质，在一定程度上可避免副作用的发生。我们通过研究绿原酸对人骨肉瘤MG63 细胞生物学行为的影响，进而探索绿原酸在骨肉瘤临床治疗中的应用价值。

图5 绿原酸对MG63 细胞凋亡相关基因表达的影响

肿瘤干细胞是一类具有自我更新、无限增殖和巨大分化潜能的细胞。当肿瘤干细胞不受控制时，可以无限增殖和转移。通过对肿瘤细胞干性基因的检测，可以对肿瘤细胞的增殖和转移能力有初步的判断。例如对Sox2 和Nucleostemin 的检测，Sox2 是Sox 基因家族的一员[6]，表达于胚胎干细胞，在胚胎发育中发挥重要作用；Nucleoste⁃min[7]是表达于干细胞的干预肿瘤细胞增殖的P53结合蛋白。我们的研究发现，经绿原酸干预后，上述肿瘤干性相关基因的表达下调，虽然两者基因的表达下降不能明确表明肿瘤干细胞的存在减少，但可证明绿原酸降低了MG63 细胞产生具有肿瘤干细胞特性细胞群的能力。

肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡是一个复杂的病理过程，与肿瘤发生发展密切相关，并且参与远处器官的转移。相关研究表明，肿瘤细胞的迁移过程可以视为肿瘤细胞对于人体微环境的适应过程[8]。而肿瘤细胞的侵袭，既可以通过穿过细胞外基质和血管基底膜游走至血管内；又可以与血管内皮细胞相黏附，并穿过血管内皮细胞游走至血管外[9-10]。肿瘤细胞如若侵袭性增强会对机体造成严重的伤害，与此同时，肿瘤细胞凋亡的减少会导致细胞的异常增殖[11]，对患者预后产生不良影响。

我们的研究表明绿原酸不仅可以通过降低迁移速率，致使MG63 细胞株无法适应人体微环境，进而导致肿瘤细胞易被机体清除，还能够通过抑制MG63 细胞株的迁移性及侵袭性，抑制肿瘤细胞的全身扩散。此外，实验中检测的Bcl-2和Bax 基因均是Bcl-2 家族成员，在肿瘤细胞凋亡的基因调控过程中起着至关重要的作用[12-13]。抗凋亡基因Bcl-2 经绿原酸干预后表达下降，而Bax的表达未见明显变化，用凋亡试剂盒检测细胞凋亡比例，发现经绿原酸处理后的细胞凋亡比例上升，此结果证实绿原酸促进了骨肉瘤MG63 细胞的凋亡。

在后续研究中，我们将检测更多凋亡相关基因的表达，并对各细胞系的骨肉瘤细胞，如HOS、Saos 等进行研究[14]，更精确全面地阐明绿原酸对骨肉瘤细胞凋亡的影响，对相关的凋亡机制也应做进一步探索，以期为临床治疗骨肉瘤，开发新的药物提供理论基础。

综上所述，绿原酸可以降低MG63 细胞的肿瘤细胞干性，抑制骨肉瘤细胞MG63 的增殖、侵袭和迁移，并且促进MG63 骨肉瘤细胞凋亡。这对骨肉瘤的疾病进程以及治疗有重要意义，未来有望成为治疗骨肉瘤的有效药物。