寨卡病毒NS2B蛋白的表达纯化及单克隆抗体制备

吴钰彬，李姝璇，侯汪衡，杨宏伟，赵欢，吴林丽，吴文伟，朱峻毅，张军，程通

1.厦门大学 生命科学学院 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，福建 厦门 361102；2.厦门大学 公共卫生学院，福建 厦门 361102

寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）是一种可通过虫媒、母婴等途径传播的病毒[1-3]。ZIKV 感染可引起发热、结膜炎、皮疹、关节痛等非特异性症状，也可导致婴幼儿小头症和成人格林-巴利综合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）等疾病[4-6]。近年来，ZIKV 在世界范围内多次暴发流行，截至2017年底，全球已有84 个国家和地区报告寨卡病毒病疫情，ZIKV 感染已成为当今国际公共卫生面临的重大问题之一[7]。

ZIKV 为单股正链RNA 病毒，其基因组可编码3 种结构蛋白（衣壳蛋白C、前体膜结合蛋白prM 与包膜蛋白 E）和 7 种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）[8-9]。其中，非结构蛋白的功能主要与病毒基因组的复制、转录及调节宿主细胞免疫应答有关[10-12]。ZIKV NS2B 蛋白由130 个氨基酸残基构成，相对分子质量（Mr）约为15×103，在病毒复制、组装及致病过程中具有重要作用[13-15]。研究显示，ZIKV NS2B 蛋白可与NS3 蛋白的N 端区域结合形成蛋白酶复合物，并剪切 C/prM、NS2A/2B、NS2B/NS3、NS3/NS4A及NS4B/NS5 等病毒前体蛋白[8]。抑制NS2B 与NS3 的相互作用及蛋白酶复合物的形成有望有效抑制病毒感染，是发展ZIKV 蛋白酶类抑制剂和新型抗病毒药物的一个重要方向[16-17]。目前，关于NS2B 在ZIKV 生活史及病毒与宿主细胞相互作用过程中的详细机制仍有待深入研究，加强NS2B蛋白相关研究也将有助于发展新型抗病毒药物。特异性单克隆抗体是支持蛋白功能研究的重要工具，目前尚缺乏针对NS2B 蛋白的单克隆抗体，筛选获得具有较好反应性能的特异性单克隆抗体，对支持开展相关研究具有重要意义。

我们采用大肠杆菌表达系统表达获得重组NS2B 蛋白，经免疫、融合筛选，获得了具有良好反应性的抗NS2B 单克隆抗体，并通过Western 印迹和免疫荧光等方法验证了该抗体可用于ZIKV NS2B 蛋白的免疫检测。本研究结果可为开展ZIKV NS2B 相关研究提供支持。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF 级 BALB/c 小鼠、SPF 级 F1 小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0，人胚胎肾细胞HEK-293T，非洲绿猴肾细胞Ve⁃ro，大肠杆菌 DH5α、ER2566 感受态细胞，原核表达载体质粒pGEX-6P-1 由本实验室保存；ZIKV非洲型毒株 MR766（ATCC VR1838，GenBank No.LC002520）、ZIKV 亚洲型毒株 PRVABC59（ATCC VR1843，GenBank No.KU501215）均 购 自 ATCC；ZIKV NS2B 全长基因序列Asian-NS2B（参考序列为GenBank No.KU365779）由上海生工公司合成，克隆至载体pUC57；可表达携带有Flag 标签的NS2B 蛋白的哺乳细胞表达载体质粒pcDNA3-flagNS2B 由 美 国 Howard 大 学 医 学 院 Tang Qiyi 教授馈赠[18]。

限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、DNA 相对分子质量标准、预染蛋白相对分子质量标准均购自TaKaRa 公司；微量胶回收及质粒小提取试剂盒购自 TianGen 公司；Gibson Assembly Master Mix购自 NEB 公司；Western 印迹显色试剂 Super Sig⁃nal West Femto Maximum Sensitivity Substrate 试剂盒购自Thermo Scientific 公司；转染试剂Lipo⁃fectAMINE 3000 Transfection Reagent、BCA 蛋 白浓度测定试剂盒、RIPA 裂解液（强）、Alexa Fluor 647 羊抗兔 IgG 购自碧云天公司；Anti-His 鼠抗购自北京全式金公司；Alexa Fluor 488 羊抗鼠IgG、RPMI 1640 购自 Invitrogen 公司；DMEM 培养基购自Gibco 公司；Anti-flag 兔抗购自Cell Signaling Technology 公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、多聚甲醛购自Sigma 公司；胎牛血清购自Ce⁃grogen 公司；RNAED 酶稀液购自北京万泰公司；菌 体 裂 解 液（20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH7.2）由实验室配制。

1.2 重组质粒pGEX-6P-1-NS2B的构建与鉴定

以Asian-NS2B 基因为模板，在NS2B 基因的两端设计引物 ZIKV-NS2B-F（5′-GGGCCCCTGGG ATCCCCGGAATTCATGAGCTGGCCTCCTAGCGAAG-3′，下划线序列为EcoRⅠ酶切位点）和ZIKVNS2B- R（5′- TCAGTCACGATGCGGCCGCTCGAGT TAATGATGATGATGATGGTGCCTTTTTCCAGTCTTC AC-3′，下划线序列为XhoⅠ酶切位点），通过PCR扩增，在蛋白C 端插入一段6×His 标签，切胶回收获得目的片段。将回收得到的片段与经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的载体pGEX-6P-1 连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落提取质粒并经双酶切验证，将验证正确的克隆送上海生工公司测序鉴定。

1.3 ZIKV NS2B重组蛋白的表达与纯化

将测序正确的重组质粒pGEX-6P-1-NS2B 转化大肠杆菌ER2566 表达菌株，挑取单菌落接种至5 mL LB 液体培养基中，37℃培养至菌液D600nm值为 0.6～0.8 时，加入终浓度为 5 μmol/L 的 IPTG，24℃诱导重组蛋白的表达。诱导结束后，离心收集菌体，超声波破碎，同时收集离心上清和沉淀，用10%的SDS-PAGE 鉴定重组蛋白的表达方式。采用Ni2+亲和层析从菌体上清中纯化带有His 标签的rGST-NS2B 蛋白；采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定纯化获得的重组蛋白浓度；采用SDSPAGE 进行蛋白鉴定。

1.4 单克隆抗体的制备与纯化

纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合至乳化状态，以皮下多点注射的方式免疫6 周龄BALB/c 雌鼠，免疫剂量为 100 μg/只，共免疫 3针，每次间隔2 周，每次免疫前1 d 对小鼠进行下眼眶静脉采血。细胞融合前3 d 对小鼠脾脏进行加强免疫，剂量为50 μg/只。脾脏加强免疫3 d后，取小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0 进行融合。融合后的细胞在培养的第5 d 进行换液，第7 d 取细胞上清分别进行包被重组蛋白rGST-NS2B、rGST-NS3 的 间 接 ELISA 检 测 ，对rGST-NS3 的间接ELISA 检测是用于扣除GST 蛋白免疫原性的影响。对rGST-NS2B 检测结果为单独阳性的细胞孔进行多轮克隆化，直至获得能够稳定分泌单克隆抗体的融合细胞株，取细胞上清对抗体的亚型进行鉴定。在F1 小鼠腹腔注射融合细胞株悬液，收集腹水，通过辛酸-饱和硫氨沉淀和Protein-A 亲和层析柱纯化腹水，获得纯化后的单克隆抗体。

1.5 抗体效价测定

将纯化的重组蛋白rGST-NS2B 进行ELISA 包被，采用碳酸盐缓冲液将rGST-NS2B 稀释至1 μg/mL，按每孔 100 μL 加至 96 孔板，37℃包被 4 h。用 PBST 洗板 1 次，用含 3% BSA 的 PBS 于 37℃封闭2 h。以不同稀释比例的单克隆抗体作为一抗（起始浓度为1 mg/mL，从1∶10 稀释比开始梯度稀释至1∶10 000 000），每孔100 μL，37℃孵育1 h；用 PBST 清洗 5 次，加入 100 μL 标有辣根过氧化物酶（HRP）的羊抗鼠（Goat anti-Mouse，GAM）抗体作为二抗，37℃孵育30 min；用PBST清洗 5 次，每孔加入 100 μL TMB 显色液，37℃孵育 15 min；最后加入 50 μL 终止液（2 mol/L 硫酸），用酶标仪读取D450nm值。抗体的效价为判定为阳性时的抗体最大稀释比。实验样品孔以P/N值［（样品D450nm值-空白对照D450nm值）/（阴性对照D450nm值-空白对照D450nm值）］≥2 时判定为阳性，阴性对照为无关抗体检测孔。

1.6 Western印迹

收集感染与未感染ZIKV MR766 毒株、PRV⁃ABC59 毒株 48 h 后的 Vero 细胞，以及转染真核表达质粒pcDNA3-flagNS2B 和pcDNA3 空载质粒48 h 后的 HEK-293T 细胞，用含有 1 mol/L PMSF 的RIPA（强）裂解液冰上裂解细胞5 min，加入6×上样缓冲液，沸水浴10 min 后进行12% SDSPAGE。电泳结束后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用BSA 室温封闭1 h，以纯化获得的NS2B单克隆抗体2H11 作为一抗（浓度1 μg/mL），37℃孵育 1 h；以 HRP 标记的 GAM 抗体为二抗，37℃孵育40 min；最后采用Super Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrate 试剂盒进行显色并拍照观察。

1.7 免疫荧光检测

在24 孔细胞培养板中放入洁净的盖玻片，接种Vero 或 HEK-293T 细胞（约 5×103/孔）。在感染与未感染ZIKV MR766 毒株、PRVABC59 毒株48 h 后的Vero 细胞和转染空载体pcDNA3 及真核表达质粒 pcDNA3-flagNS2B 的 HEK-293T 细胞中，依次加入预冷的4%多聚甲醛和含0.1% Triton X-100 的 PBS 进行 10 min 细胞固定和 15 min 细胞通透；采用20%山羊血清封闭20 min；以2H11 单克隆抗体或Anti-flag 单克隆抗体为一抗，用NRAED酶稀液将抗体稀释至10 μg/mL，37℃孵育1 h；以Alexa Fluor 488 标记的GAM 抗体或Alexa Fluor 647 标记的山羊抗兔 IgG（Goat anti-Rabbit，GAR）抗体为二抗，37℃避光孵育30 min，用DAPI 进行细胞核染色5 min，最后加入封片剂，晾干后用荧光显微镜进行图像观察和采集。

2 结果

2.1 ZIKV NS2B重组蛋白的表达、纯化与鉴定

将测序正确的NS2B 重组蛋白表达质粒pGEX-6P-1-NS2B 转化大肠杆菌ER2566 并诱导表达，采用SDS-PAGE 分析重组蛋白表达情况。结果显示，与未诱导组相比，IPTG 诱导组在预期的Mr约 42×103位置（重组 NS2B 蛋白的 N 端和 C 端分别带有GST 标签和His 标签，单独NS2B 蛋白的Mr约 15×103，GST 标签蛋白约 27×103）有明显的重组蛋白表达条带（图1A）。对诱导组菌体细胞进行超声波破碎处理后分析显示，NS2B 重组蛋白以可溶形式表达（图1B）。将菌体超声波破碎后获得的离心上清应用Ni2+柱亲和层析法对目标蛋白进行纯化，采用250 mmol/L 咪唑洗脱蛋白，将穿透样品和洗脱样品分别进行SDS-PAGE 分析。结果显示，洗脱液中在预期42×103位置可获得较高纯度的重组蛋白。进一步应用抗His 抗体进行Western 印迹检测（图1C），该主要蛋白条带为预期目标蛋白，可用于后续免疫和抗体制备研究。

2.2 ZIKV NS2B单克隆抗体的制备及性质鉴定

将获得的重组NS2B 蛋白免疫BALB/c 小鼠，应用杂交瘤技术、ELISA 检测筛选和细胞株克隆化筛选，获得1 株能够稳定分泌抗ZIKV NS2B 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2H11。应用单克隆抗体小鼠腹水制备方法制备并纯化获得了单克隆抗体2H11（图2A）。应用小鼠抗体分型试剂盒对单抗2H11 的亚型进行鉴定，结果显示2H11 为IgG1 亚型。为了验证2H11 是否可用于NS2B 蛋白的免疫检测，应用单抗2H11 对ZIKV NS2B 真核表达质粒pcDNA3-flagNS2B 和对照质粒pcDNA3 分别转染 48 h 后的 HEK-293T 细胞进行Western 印迹和免疫荧光检测。Western 印迹结果显示，2H11 与转染pcDNA3-flagNS2B 质粒的细胞裂解样品具有特异反应，反应条带相对分子质量约为15×103，与NS2B 蛋白的理论大小基本一致，且该抗体与转染pcDNA3 的细胞裂解样品无明显反应（图2B）。免疫荧光检测结果显示（图2C），2H11 可与转染pcDNA3-flagNS2B 质粒后的HEK-293T 细胞产生特异免疫荧光反应，由于pcDNA3-flagNS2B 质粒表达的 NS2B 蛋白携带 Flag 标签，本研究也同时应用Anti-Flag 兔抗对转染后细胞进行免疫荧光检测，结果显示，NS2B 单抗2H11 反应产生的绿色荧光信号与Anti-Flag 兔抗反应产生的红色荧光信号在pcDNA3-flagNS2B 转染后细胞的胞质中为共定位，而在未进行质粒转染或转染对照质粒pcDNA3 的细胞中均无特异性反应。上述结果说明，本研究构建的单抗2H11 可用于细胞中表达的NS2B 抗原的免疫检测。

2.3 抗体2H11对ZIKV感染细胞中NS2B蛋白的检测

图1 寨卡病毒NS2B 重组蛋白的表达纯化与Western 印迹鉴定

本研究进一步分析了单抗2H11 是否可用于检测ZIKV 感染后细胞中的NS2B 抗原。分别对感染与未感染ZIKV 亚洲型代表性毒株PRVABC59毒株或非洲型代表性毒株MR766 的Vero 细胞进行Western 印迹和免疫荧光检测。Western 印迹结果显示（图3A），抗体2H11 可与感染PRVABC59毒株或MR766 毒株的细胞裂解样品特异反应，反应条带大小约为15×103，与NS2B 蛋白的理论大小相符，而与未被病毒感染的Vero 细胞裂解样品无特异性反应。免疫荧光检测结果显示（图3B），2H11 与 PRVABC59 毒 株或 MR766 毒株感 染 后的Vero 细胞均有特异性反应，与未感染病毒的对照Vero 细胞无反应。上述结果说明，本研究构建的单克隆抗体2H11 可用于ZIKV 感染后细胞中的NS2B 抗原的免疫检测。

3 讨论

ZIKV 的感染与脑膜炎、急性睾丸炎、急性播散性脑脊髓炎、呼吸窘迫综合征、心力衰竭和严重血小板减少症等多种疾病有关，目前尚无针对ZIKV 的特效药和疫苗上市[19-22]。制备可靶向病毒重要蛋白的单克隆抗体，有助于为ZIKV 蛋白功能研究及抗病毒药物研究提供支持。

图2 抗体纯化及鉴定Western 印迹检测NS2B 重组蛋白

图3 NS2B 蛋白在感染不同亚型ZIKV 毒株的Vero 细胞中的表达

NS2B 是ZIKV 的重要非结构蛋白，可以激活NS3 蛋白并形成NS2B-NS3 蛋白酶复合物，该复合物具有剪切病毒前体蛋白功能，对蛋白质的加工成熟和病毒的复制、致病具有重要作用[8,14-15]。研究显示，在病毒感染过程中，NS2B-NS3 蛋白酶复合物可通过大量消耗宿主细胞的自噬相关蛋白ATG16L1 和真核翻译起始因子eIF4G1 来协助病毒逃避宿主的免疫系统，并促进自身复制[23]。目前，关于NS2B 蛋白在宿主细胞内的发展过程及ZIKV 感染、复制等问题仍有待进一步阐释。由于NS2B 及相关病毒抗原在ZIKV 感染中的重要作用，以NS2B-NS3 蛋白酶复合物为靶点，抑制NS2B-NS3 蛋白酶复合物的形成是目前开展新型抗病毒药物研究的重要方向。已有研究筛选获得了3 种具有抑制ZIKV 感染功能的化合物替莫卟酚、氯硝柳胺和硝唑尼特，其中的替莫卟酚可通过结合NS2B 关键残基和NS3 的“口袋区”发挥抗病毒作用，该化合物不仅可以抑制人胎盘和神经祖细胞中的ZIKV 复制，还可以减少小鼠模型中由ZIKV 感染导致的病毒血症和小鼠死亡[16]。近期有研究发现，小分子抑制剂5-amino-1-（（4-methoxyphenyl）sulfonyl）-1H-pyrazol-3-yl benzoate也可与NS2B-NS3 蛋白酶复合体共价结合，使该复合体产生紧凑的闭合构象，从而无法发挥蛋白水解酶功能[24]。本研究构建的靶向NS2B 蛋白的单克隆抗体2H11 可为相关研究提供重要支持。

本研究采用原核细胞表达纯化的重组NS2B蛋白作为免疫原，制备获得靶向ZIKV NS2B 蛋白的单克隆抗体。这种方法相比采用完整病毒或真核细胞表达抗原作为免疫原具有操作相对简单和实验效率高的优点。通过Western 印迹和免疫荧光检测验证了构建获得的单抗2H11 可用于ZIKV 病毒感染后细胞或真核表达质粒转染后细胞中表达的NS2B 蛋白的免疫检测反应。在后续研究中，将进一步对单抗2H11 在ZIKV NS2B 蛋白上的结合表位进行鉴定。考虑到黄病毒属内各成员病毒的NS2B 蛋白存在一定的氨基酸序列保守性，该抗体是否与其他黄病毒的NS2B 蛋白具有反应性也有待进一步验证。

综上，本研究制备获得了可与ZIKV NS2B 蛋白具有良好免疫反应活性的单克隆抗体2H11，可为NS2B 蛋白的鉴定、功能及抗病毒药物等研究提供支持。