免疫荧光成像技术在骨架细胞生物学实验教学中的应用

张运峰，马超颖，胡 芬，陈 超

（1. 唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000；2. 华北理工大学 生命科学学院，河北 唐山 063210）

细胞骨架由微管、微丝以及中间丝组成，是真核细胞的重要结构组分，参与了细胞内物质运输、细胞器的定位和细胞分裂等许多重要的细胞生命活动。细胞骨架的发现在细胞生物学发展历程上具有里程碑式的意义[1]，早已成为生命科学研究的热点。细胞骨架的观察实验是细胞生物学本科实验教学中开出率最高的项目之一[2]，可以帮助学生深刻理解细胞活动的复杂性，还可以提高他们深入探索细胞奥秘的兴趣[2]。传统的本科细胞骨架教学实验一般是以洋葱表皮细胞为实验材料，采用考马斯亮蓝对细胞骨架染色后用普通的光学显微镜观察。由于考马斯亮蓝染料能对所有的蛋白着色，并不具有针对细胞骨架染色的特异性[3-4]，因此导致学生实验中难以分辨清楚洋葱内表皮细胞中的微丝结构。

免疫荧光试验是用特异性抗体与标本中相应抗原反应后，再用荧光素标记的第二抗体（抗抗体）与之结合，然后在荧光显微镜下观察实验结果。该法具有特异性强、可操作性和重复性好、结果稳定、受环境因素影响小等优点，在科研中被广泛应用[5]。我们尝试将这一技术引入到骨架细胞观察实验教学中，取得了较好教学效果

1 材料

1.1 细胞株

Hela 细胞，培养条件：37 ℃、5%CO2；1640培养基，含10%小牛血清及1%双抗。

1.2 主要试剂和仪器

细胞固定液、PBS 缓冲液、TritonX-100、抗荧光淬灭封片剂，均购自索莱宝生物技术公司；鼠抗人的单克隆抗体和FITC 标记的羊抗鼠的荧光二抗，均购自Sigma 公司。

细胞成像系统（Thermofisher，EVOS FL），二氧化碳培养箱（Thermofisher，4111）。

2 方法

2.1 细胞的培养

实验前一天，选择生长状态良好的Hela 细胞，经过胰酶消化、细胞计数板计数和全培养基稀释，获得1×104/ml 的细胞悬液。按照200 μL/孔的标准，接种细胞于48 孔细胞培养板中，37 ℃、5%CO2条件下培养过夜。

2.2 细胞的固定、通透和封闭

（1）洗涤：取出细胞，用500 μL/孔的PBS缓冲液洗涤2 次，每次10 min。

（2）固定：200 μL/孔的多聚甲醛进行细胞固定，室温静置20 min。

（3）通透：0.3%PBS-TritonX-100 200 μL/孔，室温静置5 min。

（4）洗涤：去掉PBS-TritonX-100 处理液，500 μL/孔PBS 缓冲液洗涤2 次，每次10 min。

（5）封闭：吸去PBS 缓冲液，加入100 μL/孔1%PBS-BSA 封闭液，37 ℃，30 min。

2.3 抗体的标记和DAPI 染色

将封闭液去掉，滴加100 μL 一抗稀释液，37 ℃孵育30 min，用PBS 缓冲液洗涤3 次，每次3 min；滴加100 μL FITC 标记荧光二抗，37 ℃孵育20 min，PBS 洗涤1 次，5 min；滴加100 μL的抗荧光淬灭剂。

2.4 细胞的荧光观察

使用屏幕式倒置荧光显微镜观察细胞骨架。

3 影响实验效果的因素分析

免疫荧光技术应用到细胞骨架观察实验教学中，是一种新的尝试。经过大量实验，发现实验材料的选取、细胞融合度的选择、细胞爬片的选择、观察装置的选择、教学组织形式的选择等因素对实验教学效果影响较大。

3.1 实验材料的选取

选取生长较快、易于培养的细胞系，实验成功率更高。

3.2 细胞融合度的选择

细胞的密度控制在50%～80%，能取得最佳效果，过高的融合度会形成很强的干扰效应，降低荧光成像清晰度。

3.3 细胞爬片的选择

实验没有采用传统的细胞爬片[6,7]，而是改进为48 孔板接种，这不仅简化了实验准备步骤，降低实验过程的难度，利于学生的操作，同时也增强了指导教师对学生的操作过程掌控，保证了教学的效果。

3.4 观察装置的选择

选择屏幕式倒置显微镜或者带显微照相系统的荧光显微镜进行观察，实时呈现并记录保存实验结果。图像的即时呈现有利于学生初步了解和分析实验结果，及时保则便于多组间的结果比较，并减少荧光淬灭现象对实验结果细节的影响。

3.5 教学组织形式的选择

荧光显微镜数量是免疫荧光实验教学效果的一个制约因素。采用分组实验的模式，通过优化实验步骤，使分组数量和小组各步骤间隔时间相适应；再通过合理延长个别步骤的时间，可以使各组按序进行，避免不同组重叠交叉，保证教学组织有序、迅捷。

4 结果与讨论

FITC 标记的细胞骨架经蓝光激发后，绿色荧光覆盖了整个细胞，丝状骨架结构明显（图1）。在细胞的中心位置有一个荧光强度较弱的近圆形区域暗区，推测其为细胞核；荧光由其向四周延展，充满整个细胞，且越靠近该区域，荧光的强度越强，骨架纤维越明显。实验的荧光图像结果与细胞骨架在细胞中实际分布高度一致，确定了本实验的准确性。当学生熟悉这一技术的操作后，可以让学生探索温度、抗体结合时间、抗体浓度等因素对实验结果的影响。有条件的实验室也可开展用罗丹明标记的鬼笔环肽染色观察微丝、采用多色免疫荧光分别标记不同细胞骨架，使实验结果更丰富、有趣。

图1 Hela 细胞骨架的间接免疫荧光观察