芒针对脊髓损伤大鼠运动功能和炎症水平的影响

吕建兰,胡劲涛,柴乐,钱剑胜,任伟凡,全仁夫

(1.浙江中医药大学,杭州 310053;2.浙江中医药大学附属江南医院,萧山 311200)

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)作为脊柱损伤后最严重的并发症之一,每年发病率约为20～40例/100万人[1],其致残率高、治愈率低,给患者身心带来严重创伤。脊髓在遭受直接外力后,会出现不可逆的原发性损伤,在原发性损伤的几秒钟内,机体会启动一系列继发性级联反应,包括炎性反应、细胞凋亡、自由基损伤等,从原发性损伤部位扩散,造成脊髓的二次损伤,导致患者运动、排尿功能丧失[2]。前期研究发现,芒针秩边和水道穴可以减少神经细胞凋亡,改善大鼠排尿功能[3-4]。本实验通过芒针深刺秩边穴,观察芒针干预后大鼠运动功能变化和炎症因子含量的变化,探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级成年雄性 Wister大鼠 81只,体质量(230±20)g,购自上海斯莱克实验动物责任有限公司[动物使用许可证号为 SCXK(沪)2017-0005],由浙江中医药大学实验动物中心分笼饲养,每笼4只,温度20～24℃,湿度50%～70%,适应性饲养1周后进行实验。

1.2 主要试剂与仪器

苏木素-伊红(上海依赫生物科技有限公司)、乙醇(杭州化学试剂有限公司)、二甲苯(广州市振发贸易有限公司)、盐酸(济南坤丰化工有限公司)、氨水(杭州长征化工厂)、多聚甲醛(天津市化学试剂研究所)、酶联免疫检测试剂盒(R&D,美国)、TaKaRa试剂盒(Invitrogen公司,美国)、Trizol试剂(Invitrogen公司,美国);0.30 mm×50 mm针灸针(江苏佳辰牌),10 g克氏针(江苏金鹿医疗器械公司,ZX105),恒温箱(上海森信实验仪器有限公司),匀浆器(金伟实验仪器,江苏),Bio-Tek ELX800全自动酶标仪(Thermo Scientific Varioskan Flash),AP280-2包埋机(MICROM公司),HM335E切片机(MICROM公司),Nikon eclipse 80i显微镜(Nikon公司),Step one plus PCR仪(美国ABl)。

1.3 脊髓损伤模型的建立

应用改良 Allen's造模法[5]制备大鼠脊髓损伤模型,实验顺序随机进行。大鼠称重后用 3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg)[6]腹腔注射麻醉,待大鼠无四肢反应后将其俯卧位于操作台上,以第11肋为标志找出T11棘突,沿背部正中由T11棘突向头部方向作一长约2.5 cm的切口,钝性分离椎旁肌肉,咬除 T9-10棘突及全部椎管,暴露 0.5 cm宽硬膜,用自制的改良打击装置(质量为10 g的克氏针沿带有刻度的透明管从60 mm高处垂直自由下落,致伤量为60 g/cm)造成脊髓中度损伤,使大鼠出现痉挛性摆动、摆尾反射,致伤后迅速移开打击物,逐层缝合切口,大鼠出现双下肢迟缓性瘫痪,BBB评分小于2分,证明造模成功[7-8]。造模后每日2次人工膀胱按摩协助排尿。

1.4 大鼠分组及处理

选择健康雄性Wister大鼠81只,随机分为正常组9只、模型组36只和芒针组36只,分别于术后1 d、3 d、5 d、7 d行BBB评分,术后1 d、3 d、5 d、7 d取受损段脊髓行ELISA检测、RT-qPCR检测和HE染色。模型组大鼠正常饲养不作其他处理,芒针组大鼠于术后麻醉苏醒后开始行双侧秩边穴芒针治疗,每日1次,每次30 min,治疗前需人工按摩排空膀胱。

1.5 实验干预

参照《实验针灸学》[9]取穴标准确定大鼠秩边穴,在臀外下部,股骨大转子与荐椎尾椎结合部连线外1/3与中1/3交点处(图1[10])。针刺前人工按摩排空膀胱,用长50 mm针灸针在大鼠秩边穴直刺,轻捻缓进达同侧腹部皮下,深度2 cm左右(图2),每5 min捻转行针1次,30 min后出针。

图1 大鼠秩边穴示意图

图2 大鼠针刺图

1.6 行为学观察及运动功能评价

参照Basso DM等[11]BBB运动功能评分法,分别于术后1 d、3 d、5 d、7 d对大鼠后肢运动功能进行评价,评分范围为0～21分。采用双人双盲独立观察,观察者为非本组实验人员,但对评分标准熟悉。因大鼠昼夜活动差别较大,评分均于晚上 7点进行,观察期为2 min,每只测3次,取其平均值,最后结果为两位观察者的平均记录分数。评价前检查所有动物膀胱是否充盈,以免因膀胱充盈而影响活动。

1.7 脊髓组织取材

将正常组大鼠及1 d、3 d、5 d、7 d的模型组和芒针组大鼠随机取6只,腹腔注射过量戊巴比妥钠,待动物麻醉后于冰上迅速剪取长约1 cm受损段脊髓组织存入-80℃冰箱,用于ELISA检测和RT-qPCR检测;每组另取3只大鼠,戊巴比妥钠深度麻醉,生理盐水心脏灌注后迅速取损伤段脊髓,4%多聚甲醛固定,乙醇梯度脱水,透明后浸腊包埋,连续切片,片厚4 μm,用于苏木素-伊红染色。

1.8 指标检测

1.8.1 ELISA检测

按照大鼠 HMGB1、NF-κB、IL-6酶联免疫检测试剂盒使用说明书进行操作,采用生物素双抗夹心技术检测脊髓组织中 HMGB1、NF-κB、IL-6水平。简要实验步骤为准备试剂(生物素标记的抗 HMGB1抗体、抗NF-κB抗体、抗IL-6抗体、链霉亲和素-HRP),将标准品梯度稀释;加入准备好的样品、标准品、生物素标记二抗和酶标试剂,37℃反应1 h;洗板5次,加入显色液A、B,37℃避光显色 10 min;加入终止液终止反应;10 min内读取各孔的吸光度(OD值)。根据标准液的检测结果得出标准曲线,求出各组样品的实际浓度。

1.8.2 HE染色

将切片置60℃烤箱烘烤2 h,二甲苯、乙醇梯度脱水后苏木素初染5 min,流水冲洗2 min,0.5%盐酸乙醇分化5 s,流水冲洗1 min,0.5%稀氨水返蓝20 s,流水冲洗3 min,0.5%伊红染液染色2 min,流水冲洗1 min,80%和 95%乙醇依次脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,Nikon DS-Fi1 500万象素 CCD相机(Nikon,Tokyo,apan)摄片。

1.8.3 RT-qPCR检测

采用Trizol法分组提取总RNA,检测RNA浓度及纯度。按照TaKaRa试剂盒说明书进行反转录反应,以待检测基因的引物为模板(引物序列见表1),采用Step one plus PCR仪(美国 ABl)进行荧光定量 PCR检测,以β-actin作为内参进行相对定量分析。

表1 引物序列

1.9 统计学方法

应用SPSS20.0统计软件分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,采用重复测量方差分析检验主效应、时间效应和交互效应,组间差异采用单因素方差分析,两两比较应用LSD法(方差齐)或Tunnett T3法(方差不齐)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学观察和BBB评分

脊髓损伤后,模型组和芒针组大鼠的 BBB评分明显低于正常组,差异有统计学意义(P＜0.01);芒针治疗后,芒针组大鼠的BBB评分高于模型组,在5 d和7 d时差异有统计学意义(P＜0.01),说明芒针的治疗效果与治疗疗程之间存在时间效应(P＜0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠BBB运动功能评分比较 (,分)

表2 各组大鼠BBB运动功能评分比较 (,分)

注:与正常组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.01

模型组 9 1.00±0.661) 1.80±0.911) 2.20±0.631) 3.20±0.631)芒针组 9 1.30±0.671) 2.40±0.841) 4.60±0.961)2) 7.40±1.071)2)正常组 9 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00

2.2 脊髓组织中HMGB1、NF-κB及IL-6水平比较

为了测试芒针治疗是否可抑制 HMGB1、NF-κB、IL-6等相关炎性因子的表达,分析了损伤节段脊髓组织中HMGB1、NF-κB、IL-6水平及HMGB1mRNA、NF-κBmRNA、IL-6mRNA水平。脊髓损伤后,模型组和芒针组大鼠脊髓组织中 HMGB1、NF-κB、IL-6水平及 HMGB1mRNA、NF-κBmRNA、IL-6mRNA水平较正常组升高,差异有统计学意义(P＜0.05);芒针治疗后,芒针组大鼠脊髓组织中HMGB1、NF-κB、IL-6水平及HMGB1mRNA、NF-κBmRNA、IL-6mRNA水平较模型组下降,在3 d、5 d和7 d时差异有统计学意义(P＜0.05),说明芒针治疗对炎症因子的表达具有明显的抑制作用。详见表3-8。

表3 各组大鼠脊髓组织中HMGB1水平比较 (,ng/mL)

表3 各组大鼠脊髓组织中HMGB1水平比较 (,ng/mL)

注:与正常组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

模型组 6 1.902±0.1161) 1.940±0.0981) 1.933±0.1021) 1.931±0.0971)芒针组 6 1.796±0.0681) 1.706±0.0581)2) 1.637±0.0681)2) 1.591±0.0551)2)正常组 6 1.316±0.011 1.316±0.011 1.316±0.011 1.316±0.011

表4 各组大鼠脊髓组织中NF-κB水平比较 (,pg/mL)

表4 各组大鼠脊髓组织中NF-κB水平比较 (,pg/mL)

注:与正常组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

组别 n 术后1 d 术后3 d 术后5 d 术后7 d模型组 6 2229.16±141.281) 2295.42±98.361) 2244.07±107.111) 2223.36±200.441)芒针组 6 2056.73±157.741) 1770.72±100.281)2) 1639.63±131.401)2) 1564.06±173.121)2)正常组 6 1346.10±131.50 1346.10±131.50 1346.10±131.50 1346.10±131.50

表5 各组大鼠脊髓组织中IL-6水平比较 (,pg/mL)

表5 各组大鼠脊髓组织中IL-6水平比较 (,pg/mL)

注:与正常组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

模型组 6 289.89±18.391) 303.55±20.591) 292.21±16.021) 282.94±24.151)芒针组 6 281.05±15.091) 244.24±17.531)2) 193.66±18.361)2) 179.29±22.441)2)正常组 6 109.87±9.37 109.87±9.37 109.87±9.37 109.87±9.37

表6 各组大鼠脊髓组织中HMGB1mRNA水平比较 ()

表6 各组大鼠脊髓组织中HMGB1mRNA水平比较 ()

注:与正常组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

组别 n 术后1 d 术后3 d 术后5 d 术后7 d模型组 6 0.000907±0.0000331) 0.001263±0.0000601) 0.001123±0.0000401) 0.000992±0.0000441)芒针组 6 0.000911±0.0000321) 0.000885±0.0000211)2) 0.000858±0.0000211)2) 0.000799±0.0000281)2)正常组 6 0.000627±0.000028 0.000627±0.000028 0.000627±0.000028 0.000627±0.000028

表7 各组大鼠脊髓组织中NF-κBmRNA水平比较 ()

表7 各组大鼠脊髓组织中NF-κBmRNA水平比较 ()

注:与正常组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

组别 n 术后1 d 术后3 d 术后5 d 术后7 d模型组 6 0.001498±0.0000301) 0.001663±0.0000441) 0.001593±0.0000471) 0.001500±0.0000381)芒针组 6 0.001275±0.0000361) 0.001208±0.0000301)2) 0.001130±0.0000441)2) 0.000992±0.0000311)2)正常组 6 0.000759±0.000026 0.000759±0.000026 0.000759±0.000026 0.000759±0.000026

表8 各组大鼠脊髓组织中IL-6mRNA水平比较 ()

表8 各组大鼠脊髓组织中IL-6mRNA水平比较 ()

注:与正常组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

组别 n 术后1 d 术后3 d 术后5 d 术后7 d模型组 6 0.001697±0.0000611) 0.001799±0.0000421) 0.001680±0.0000791) 0.001486±0.0000271)芒针组 6 0.001541±0.0000381) 0.001453±0.0000521)2) 0.001370±0.0000391)2) 0.001323±0.0000411)2)正常组 6 0.000934±0.000059 0.000934±0.000059 0.000934±0.000059 0.000934±0.000059

2.3 脊髓组织的HE染色

正常组脊髓灰质和白质结构正常,神经细胞呈正常的组织结构,神经元细胞类圆形,胞浆丰富,边界清晰,周围有较多的中小型神经细胞及胶质细胞;模型组脊髓组织松散,灰质中有许多空洞形成,伴有炎性细胞浸润,神经元细胞固缩;芒针组在损伤初期,脊髓构造欠清晰,损伤部位的空洞明显,残留的神经元结构不清,随着治疗周期延长,损伤部位的空洞及炎性细胞逐渐减少,神经元细胞形态好转。详见图3。

3 讨论

众所周知,炎症反应是脊髓损伤后继发性损害的主要机制之一。脊髓损伤后的炎症浸润,会扩大脊髓坏死和凋亡的实际部位,加剧脊髓组织变性,抑制脊髓功能恢复[12]。大量临床研究发现,许多疾病的发生、发展均与HMGB1参与的炎症反应相关[13-14]。HMGB1作为一种重要的促炎介质,其表达的增加可能直接导致下游炎症因子表达的上调[15];IL-6主要是由T细胞和巨噬细胞分泌,刺激免疫反应,是引起炎症反应的重要促炎因子[16-17],当它与HMGB1结合后可增强炎症反应的活性;NF-κB是介导炎症反应重要的转录因子,其参与调节许多炎症的基因和信号通路[18],而其介导的信号通路可调控相关促炎因子的表达[15]。通过实验证明了脊髓损伤后 HMGB1、NF-κB和 IL-6呈高表达,芒针治疗一段时间后,HMGB1、NF-κB和IL-6表达明显降低,而未予任何治疗的模型组,HMGB1、NF-κB和IL-6仍处于高表达状态。从而推测,芒针的抗炎机制可能包括抑制HMGB1的表达,降低NF-κB信号通路的传导,下调促炎因子IL-6的分泌。

针灸作为中医学的瑰宝,具有抗炎、抗凋亡、镇痛等作用[19],芒针作为一种特制的长针,因形状细长如麦芒,故称芒针。《灵枢·九针论》记载:“八曰长针,取法于綦针,长七寸,主取深邪远痹者也。”芒针的针刺特点是深刺透穴,其取穴精简,针感强,通过穴位、经络和神经体液起到加强表里经、邻近经的经气流通,特别适合瘫痪、软组织疼痛等疾病的治疗[20]。本研究结果显示,芒针治疗后大鼠的BBB评分比未治疗大鼠高,随着治疗周期的延长,两组评分差异加大,说明芒针治疗对脊髓损伤后大鼠运动功能的恢复有促进作用。

根据中医学气血经络理论,脊髓所过之处可受督脉、膀胱经及华佗夹脊的经气濡养,许多研究选用损伤段局部的夹脊穴针刺,直达病所,促进损伤后神经功能的重建[21-22]。因本实验脊髓损伤模型大鼠椎板被咬除,针刺夹脊穴或者督脉穴位,易刺伤脊髓,故未采用损伤局部的夹脊穴作研究。而且,课题组大量研究发现秩边穴透刺,也可促进神经功能的恢复[23]。秩边穴[24]属足太阳膀胱经穴,位于第21椎下旁开3寸,与骶管裂孔相平,深层正对坐骨大孔,有臀下血管、臀下神经、股后皮神经、阴部神经及坐骨神经通过,是芒针重用穴之一,对秩边穴行不同方向和深度的针刺,伴随针感传导部位的不同,所治之症也各异,既可治疗小便不利,又可治疗下肢痿痹[25],《中华特针临床发挥》一书中就有秩边穴直刺治疗下肢痿证的记载。笔者通过临床实践发现,当秩边穴深刺至坐骨大切迹后上方髂翼外面的骨面,酸胀感可向同侧下肢放射至小腿或足踝部,产生与透刺相当的针感,这样也可避免透刺过程中因操作人员解剖不熟练而造成局部的神经损伤。本实验采用大鼠秩边穴深刺,针尖直抵同侧腹部皮下,进针深度 2 cm左右,手下有沉紧感为得气。

据《黄帝内经》记载,脊髓损伤应按“体堕”和“痿证”进行辨证论治,“体堕”指的是急性脊髓损伤,而“痿证”多指慢性脊髓损伤或急性脊髓损伤后期。中医学在治疗“痿证”上疗效确切,临床报道并不少见,但关于“体堕”治疗的报道却不多,曾有人提出在急性脊髓损伤术后立即配合针灸、中药治疗,可有效降低脊髓损伤的并发症,而且,针灸干预越早,患者神经功能恢复的情况越好[26]。本研究通过人为条件造成大鼠急性脊髓损伤模型,通过检测发现损伤段脊髓组织中的HMGB1、NF-κB及IL-6大量聚集,HMGB1作为一种重要的促炎症反应的DNA结合蛋白[27-28],可能是脊髓损伤后炎症信号的触发器[29],可导致促炎因子 IL-6的释放,当IL-6与HMGB1结合后又可增强炎症反应的活性;同时,脊髓损伤后NF-κB的大量表达,也可调控促炎因子IL-6的表达。所以,三者之间相互作用,介导了脊髓损伤后的炎症级联反应[30]。因此推测,作为促炎介质的HMGB1可能协同相关炎症因子参与脊髓损伤后的炎症反应,加剧脊髓损伤,影响大鼠运动功能的恢复,但其具体调控通路尚不清楚,这也是本课题组下一步的研究方向。另外,观察各时间点大鼠的BBB评分发现,同一时间点,芒针治疗组大鼠的运动评分较模型组高,脊髓组织中的炎性因子表达较模型组明显减少,表明芒针对脊髓损伤后的炎症反应有一定抑制作用,其抗炎机制可能包括抑制HMGB1的表达,降低 NF-κB信号通路的传导,下调促炎因子IL-6的分泌。芒针作为中医学中一种特殊的疗法,从治疗的指导思想到选穴配方,都有其独特之处,有望在神经系统、运动系统、精神系统等多学科中发挥其优势。