酶法制备根皮素工艺条件的研究

李慧灵，陈宏基，林育成，叶德晓，周金林

(广东金骏康生物技术有限公司，广东 佛山 528000)

根皮素是一种天然的二氢查尔酮类化合物，主要存在于蔬菜以及苹果、梨等水果中，具有抗氧化[1-2]、抑菌[3-4]、抑制肿瘤细胞增殖[5]、抗炎[6]、抑制酪氨酸酶活性[7]等作用，因此在食品、药品、化妆品等领域具有较大的应用前景[8-10]。目前根皮素的制备方法主要有:1) 植物提取法，此种方法因根皮素在天然植物中的含量相对较低，提取成本较高[11-12]；2) 传统的化学法，利用根皮苷经酸(通常是硫酸或盐酸)水解制备根皮素，此种方法用到了盐酸或硫酸，给环境造成很大污染[11,13]；3) 酶法转化，即利用根皮苷为原料，经糖苷酶反应，得到根皮素，此种方法由于反应温和，操作简单，成本低，受到诸多学者的青睐[14-15]。由于酶的性质受很多因素的影响，因此要对酶以及转化工艺进行优化。汪瑾雨等[16]利用酿酒酵母发酵液对根皮苷进行生物转化，通过单因素和响应面法优化工艺条件，最终的产率为70.97%，换算成转化率只有45%；梅建凤等[17]从苹果皮富集培养物中分离筛选出紫变青霉，通过其发酵的酶液对根皮苷进行生物转化，并对转化条件进行优化研究最终转化率为90.3%，但是酶液的发酵只是在摇瓶阶段，并不能满足生产的需要。笔者从市售的5种糖苷酶中筛选出一种较优的酶，并对酶解工艺进行优化，使根皮素的转化率大大的提高，为工业化生产提供可靠的参考。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

90%纯度根皮苷，长沙中仁生物科技有限公司；β-葡萄糖苷酶，夏盛酶制剂有限责任公司；纤维二糖酶，夏盛酶制剂有限责任公司；β-葡聚糖酶，安琪酵母酶制剂公司；纤维素酶，山东蔚蓝生物；多糖水解酶，云南睿丹生物技术有限公司；根皮苷标准品(纯度≥98%)、根皮素标准品(纯度≥98%)，购自上海金穗生物科技有限公司；一水柠檬酸(纯度≥99.5%)和十二水合磷酸氢二钠(纯度≥99%)，购自广东光华科技股份有限公司。

1.2 设 备

水浴摇床HT-110X30，上海赫田科学仪器有限公司；液相色谱仪安捷伦1100，安捷伦科技中国有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 根皮苷转化根皮素生物酶的筛选

分别用纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、纤维二糖酶和多糖水解酶作用于根皮苷，分别在2，4，6，8，10 h跟踪检测根皮素转化率，根据酶厂家提供酶活最高工艺条件，其中缓冲液的倍数为缓冲液体积与底物质量的比值，筛选出最适酶的反应条件，见表1。

表1 5种酶的反应条件Table 1 The reaction conditions of five enzymes

1.3.2 根皮苷转化根皮素酶解工艺条件优化

1) 不同pH对酶解反应的影响

分别在pH 3.5,4.0,4.5,5.0,5.5条件下，以原料根皮苷40倍的缓冲液，温度50 ℃，m(底物)∶m(酶)=3∶1进行酶解反应，10 h后检测转化率。

2) 不同温度对酶解反应的影响

分别在30，40，50，60，70 ℃下，以原料根皮苷40倍的缓冲液，pH 4.0，m(底物)∶m(酶)为3∶1进行酶解反应，10 h后检测转化率。

3) 不同缓冲液的倍数对酶解反应的影响

分别在10，20，30，40，50倍的缓冲液的体系下以温度50 ℃，pH 4.0，m(底物)∶m(酶)=3∶1进行酶解反应，10 h后检测转化率。

4) 底物与酶比对酶解反应的影响

分别以m(底物)∶m(酶)为2∶1,3∶1,4∶1,5∶1,6∶1，以温度50 ℃，pH 4.0，原料根皮苷40倍的缓冲液，进行酶解反应，10 h后检测转化率。

5) 酶解时间对酶解反应的影响

以原料根皮苷40倍的缓冲液，pH 4.0，m(底物)∶m(酶)=3∶1，温度50 ℃，进行酶解反应，分别检测2，4，6，8，10，12，14 h后根皮素的转化率。

6) 正交实验优化酶解工艺

在单因素的基础上，以根皮素的转化率为指标，采用L9(34)正交表设计4因素、3水平的正交实验。每个实验做3个平行，因素水平表见表2。

表2 因素水平表Table 2 The table of factors and levels

7) 在最佳工艺下中试规模验证试验

在100 L规模下进行3批酶转化实验，以验证最佳工艺。

1.4 检测方法

1.4.1 转化率的检测方法

取一定体积已搅拌均匀的反应液，抽滤后将固体在烘箱中干燥，利用DMSO溶解至一定体积，0.45 μm的微孔滤膜过滤。采用HPLC分析滤液中的根皮素，根据根皮素的标准曲线回归方程计算根皮素的含量。根皮素的转化率计算公式为

式中：C1为转化液中根皮素的质量浓度，g/L；C2为转化液中根皮苷的质量浓度，g/L。

1.4.2 液相条件

色谱柱：XBridge C18液相色谱柱(10 μm×250 mm×4.6 mm)；V(水相)∶V(乙腈)=75∶25；流速1 mL/min；波长281 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

1.4.3 根皮素标准曲线的绘制

利用DMSO准确配制10，50，100，150，200 μg/mL的系列根皮素标准溶液。0.45 μm的微孔滤膜过滤后，取10 μL于上述色谱条件下进样分析，每个质量浓度进样3次，计算平均峰面积，以根皮素质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，得根皮素标准回归方程为Y=0.769 4X-1.645(R2=0.999 7，其中R为相关系数)。

2 结 果

2.1 根皮苷转化根皮素生物酶的筛选

5种酶酶解根皮苷转化根皮素跟踪反应情况见图1。

图1 5种酶酶解根皮苷转化根皮素的转化率比较Fig.1 Comparison of the conversion rate of phlorezin to phloretin by five enzymes

由图1可知：5种酶中，利用纤维素酶酶解根皮苷转化根皮素的转化率最高，10 h后的转化率可达86%；转化率最低的是纤维二糖酶；β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶和多糖水解酶的反应结果相差不大。纤维素酶转化率高，其成本较低，是较理想的酶。

2.2 pH对转化率的影响

不同pH的缓冲液对根皮苷转化根皮素的影响见图2。

图2 pH对转化率的影响Fig.2 The influence of pH to conversion rate

在pH为4时转化率达最高，为73%，pH高于4或低于4，转化率都会降低，说明缓冲液的pH过高或者过低都会影响纤维素酶的活性，从而影响转化率。因此笔者选择pH在3，4，5时为正交实验的3个水平。

2.3 底物与酶质量比对转化率的影响

底物与酶质量比(m(底物)∶(m(酶))对根皮苷转化根皮素的影响见图3。

图3 底物与酶质量比对转化率的影响Fig.3 The influence of ratio of substrate to enzyme to conversion rate

由图3可知：随着加酶量的增大，转化率逐渐提高，当酶与底物质量比达到3∶1后，转化率达到了90%以上，再增加酶的量，反应速率也不会大幅增加，这是因为在酶与底物质量比低于3∶1时，转化率主要受酶量的影响，而当酶与底物质量比达到3∶1以后，转化率主要受底物的影响。从生产成本上考虑，最佳的酶底比为3∶1，因此笔者选择2∶1,3∶1,4∶1这3个水平做正交实验。

2.4 缓冲液倍数对转化率的影响

缓冲液倍数对根皮苷转化根皮素的影响见图4。

图4 缓冲液倍数对转化率的影响Fig.4 The influence of multiple of buffer to conversion rate

图4可知：转化率在缓冲液倍数为40倍时达到最大，在40倍之前，随着缓冲液倍数的增加，转化率缓慢提高，达到40倍以后，再增加缓冲液的倍数转化率不再增加，这是因为缓冲液的倍数反映的是底物质量浓度，在40倍之前，底物浓度可能是酶的限制性因素，当达到一定浓度后，底物浓度不再是限制性因素，而限制性因素可能变为酶的添加量或pH，温度等别的因素的影响。从10倍到50倍的反应体系，转化率为80%～90%之间，转化率增加不明显，因此从生产上来看，缓冲液体系过小，酶与底物不能够充分接触，体系过大，对生产量影响很大，因此笔者选定40倍的体系为最佳体系。

2.5 温度对转化率的影响

不同的温度对根皮苷转化根皮素的影响结果见图5。

图5 温度对转化率的影响Fig.5 The influence of temperature to conversion rate

由图5可知：50 ℃时根皮素的转化率最高，40 ℃和60 ℃时转化率都有所下降，特别是在0 ℃，转化率大幅下降，可能此种纤维素酶对高温特别敏感，温度过高或过低都会使酶的结构发生变化，从而影响酶的活性，因此笔者在后续的正交实验中加入45 ℃和55 ℃的水平，选择45，50，55 ℃这3个温度水平。

2.6 酶解时间对转化率的影响

酶解时间对根皮苷转化根皮素的影响见图6。

图6 酶解时间对转化率的影响Fig.6 The influence of enzymolysis time to conversion rate

由图6可知：随着反应时间的延长，转化率逐渐升高，12 h以后酶转化趋于平衡，转化率不再提高。酶解时间对转化率和生产周期都有影响，因此要选择合适的酶解时间，时间太短，根皮苷转化为根皮素不充分，时间太长，会延长生产周期。笔者选择8，10，12 h 3个水平做正交实验。

2.7 单因素分析结果

对温度、pH、底物与酶质量比、缓冲液倍数、酶解时间利用SPSS 16.0进行单因素的显著性分析，结果见表3。

表3 单因素显著性分析结果Table 3 The results of single factor significance analysis

①P<0.01，表示极显著性差异。

由表3可知：温度、pH、底物与酶比，酶解时间，对根皮素的转化率都有极显著性的差异，缓冲液的倍数无显著性差异，因此选择温度、pH、底物与酶比、酶解时间做正交实验。

2.8 正交实验结果

根据表1因素水平表，按照L9(34)正交表设计正交实验，实验结果见表4。

表4 正交实验条件下的转化率Table 4 Conversion rates under orthogonal experimental conditions

由表4可知：各因素对根皮素转化率的影响大小顺序为A(温度)>D(酶与底物比)>C(酶解时间)>B(pH)，因此最佳的酶解工艺条件为A2D1C2D1，即温度50 ℃，m(底物)∶m(酶)=2∶1，酶解时间为10 h，pH为3。

2.9 最佳工艺的验证

根据正交实验优化后的工艺条件(温度50 ℃，m(底物)∶m(酶)=2∶1，酶解时间10 h，pH 3)，进行3次平行实验，工艺优化后的平均转化率可达97.03%，高于正交实验组的任何一组实验。

3 结 论

笔者以根皮苷为原料，从5种市售的酶中筛选出一种较优的酶即纤维素酶进行酶解实验，转化根皮素，通过正交实验得出了4个因素对转化率的影响顺序为A(温度)>D(酶与底物比)>C(酶解时间)>B(pH)，在温度50 ℃，m(底物)∶m(酶)=2∶1，酶解时间为10 h，pH为3的最优条件下，平均转化率为97.03%。本研究获得了利用纤维素酶转化根皮苷生成根皮素的工艺条件，与传统的化学法和酸碱法相比，反应条件温和，操作简单，效率高。实验原料根皮苷可以从苹果、湖北海棠等植物中大量获取；酶为纤维素酶，在食品、能源、饲料、酒精酿造、纺织等行业有广泛的应用，是继糖化酶、淀粉酶以及蛋白酶之后的第四大工业酶种，其已经是大规模工业化生产的产品，成本较低，来源广泛。本工艺可为酶法制备根皮素的工业化提供可靠的参考。