hsa-miR-214-3p靶基因预测及其在儿童骨肉瘤中可能的调控机制

唐 煜，赵志华，于 磊，朱广铎，彭 诚，许朝君，镐英杰

1)河南电力医院儿科 郑州 450006 2)郑州大学第一附属医院病理科 郑州 450052 3)郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052

骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，也是儿童肉瘤相关死亡的首要原因，主要发生于股骨远端和胫骨近端干骺端。骨肉瘤是高度侵袭性的肿瘤，最有可能转移到肺[1]。骨肉瘤早期很难诊断，大约一半的患者会发生转移，转移或复发的患者5 a 生存率较低[2]。因此，寻找新的生物标志物来判断骨肉瘤的预后至关重要。

miRNA可以通过靶向调控肿瘤细胞分化、增殖、凋亡和转移相关基因，发挥抑癌或促癌的作用[3]。越来越多的研究[4-6]表明， miRNA表达与骨肉瘤患儿的预后关系密切。已有研究结果显示，miR-214通过靶向TRAF3在骨肉瘤中起致癌基因的作用[7]；miR-214-3p可通过靶向CADM1促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[8]；miR-214可直接抑制LZTS1，从而促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭[9]；miR-214表达上调与儿童骨肉瘤的进展及不良预后有关[10]。本研究利用生物信息学方法分析miR-214的序列保守性，预测hsa-miR-214-3p的靶基因，并对其进行功能注释、富集性分析及信号通路富集性分析，为深入研究 hsa-miR-214-3p在骨肉瘤中的生物学功能及调控机制提供依据，为寻找以hsa-miR-214-3p为靶点治疗儿童骨肉瘤的方法提供理论指导。

1 资料与方法

1.1数据收集通过miRBase(http://www.mirBase.org/)分别检索人、小鼠、大鼠、猕猴、黑猩猩、马等物种的成熟miRNA序列，分析miR-214成熟序列在各物种间的保守性。利用PicTar、miRanda、RNAhybrid、TargetScan等4个数据库进行hsa-miR-214-3p靶基因的预测，取交集，作为进一步分析的靶基因集合。

1.2数据分析应用R包ClusterProfiler中的Gene Ontology数据库进行功能分类及富集性分析；利用KEGG数据库对靶基因集合进行信号转导通路及疾病通路富集性分析。富集显著性阈值定为0.05。

2 结果

2.1成熟miR-214序列的保守性分析序列保守性分析结果见图1，可见人、小鼠、大鼠、猕猴、黑猩猩、马等多物种的成熟 miR-214序列存在完全相同的21个碱基，因而可认为miR-214在多物种间具有较高的保守性。

2.2hsa-miR-214-3p靶基因的预测利用PicTar、miRanda、RNAhybrid、TargetScan等4个数据库预测并取交集，共发现靶基因454个(图2)。

图1 miR-214序列保守性分析

图2 hsa-miR-214-3p靶基因预测

2.3靶基因的功能富集分析对454个靶基因进行功能注释及富集分析，结果见表1～ 3。

2.4靶基因生物通路富集性分析预测的靶基因富集于TGF-β、Ras、cGMP-PKG、PI3K-Akt、Hippo、Wnt、cAMP、TNF、NF-kappa B信号通路，涉及细胞凋亡、细胞衰老、肝细胞癌、小细胞肺癌、乳腺癌、破骨细胞分化等通路(表4)。

表1 hsa-miR-214-3p预测靶基因参与的生物学过程

续表1

表2 hsa-miR-214-3p预测靶基因参与的分子功能

表3 hsa-miR-214-3p预测靶基因的细胞组分

表4 hsa-miR-214-3p预测靶基因的信号通路富集分析

3 讨论

目前，骨肉瘤的病因尚不清楚,发病的危险因素有放疗或化疗史、Paget病或其他良性骨病变史,以及遗传性疾病(包括遗传性视网膜母细胞瘤、Lifraumeni综合征、Rothmund-Thomson综合征、Bloom和Werner综合征等)。许多因素影响整个疾病过程和结局，包括年龄、肿瘤体积、肿瘤位置、手术切除缘、术前化疗的组织学反应和无复发间隔时间等[11]。

miR-214是调控骨肉瘤发病的关键miRNA之一。本研究发现miR-214成熟序列在多物种间具有高度保守性，这说明相关动物实验研究具有高度可信度与可推广性。本研究结果显示，hsa-miR-214-3p调控的靶基因参与的生物学过程主要包括囊泡介导转运的调节、外源性凋亡信号通路、凋亡信号通路中线粒体膜蛋白插入的调控、BMP信号通路、Ras蛋白信号转导的调控、肿瘤坏死因子介导的信号通路调控、骨生长、成骨细胞分化的调控、细胞衰老的负调节、TGF-β受体信号通路等；参与的分子功能包括细胞黏附分子结合、钙黏蛋白结合、泛素样蛋白结合、生长因子结合、NAD+激酶活性、磷脂酰肌醇磷酸盐结合、核输入信号受体活性、BMP受体结合、配体门控钙通道活性、Ras-鸟苷酸交换因子活性等；参与构成的细胞组件包括细胞-基质连接、运输小泡、高尔基体相关小泡、胞外小泡、转录抑制复合物、内质网管状网络、细胞质核糖核蛋白颗粒、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶复合物、核被膜等。

生物信息学分析发现RGMA、NEO1、ACVR1B、NBL1、ACVR2B等为hsa-miR-214-3p的潜在作用靶点，hsa-miR-214-3p可能通过调节这些基因间接调控TGF-β通路，从而在骨肉瘤转移中发挥重要作用。体外实验证实TGF-β1可促进骨肉瘤细胞系的迁移，具有促骨肉瘤血管生成的作用[12]。骨肉瘤患儿血清中TGF-β表达上调，其上调还与肺或其他部位的转移、高级别骨肉瘤化疗敏感性有关[13]。

本研究结果提示，Hippo通路异常在骨肉瘤生物学过程中有重要作用。Hippo通路成员中，只有YAP和TAZ在人骨肉瘤组织中被研究过。组织微阵列分析[14]结果显示，与周围非癌组织相比，骨肉瘤中YAP蛋白表达较高，且表达与临床分期有关。在另一项免疫组化研究[15]中，骨肉瘤组织中YAP和TAZ的阳性率高达60%。本研究还发现，FZD7、SENP2、TBL1XR1、VANGL2、PLCB4等为hsa-miR-214-3p的潜在作用靶点，hsa-miR-214-3p 可能通过调节这些基因间接调控Wnt通路，从而在骨肉瘤发生和进展中发挥重要作用[16]。骨肉瘤组织中Wnt通路蛋白过度表达，包括wnt配体、fzs和lrp受体等，编码内源性wnt通路抑制物(如wif-1)的基因则表观遗传沉默[16]。

综上，hsa-miR-214-3p可能通过TGF-β、Hippo、Wnt等通路调控儿童骨肉瘤的发生、进展。但当前预测miRNA靶基因的数据库数据较少，存在相关生物学知识和基因数据库不完善的缺陷，故结果存在一定的假阳性。后期我们将针对hsa-miR-214-3p在儿童骨肉瘤发生发展中的作用开展动物和临床研究，为开发以hsa-miR-214-3p为靶点的儿童骨肉瘤治疗药物提供新的思路和理论依据。