晚期非小细胞肺癌患者外周血中多个驱动基因和TP53基因检测

王 伟，谢宵靓，姜国忠，燕迪迪，夏培苡，李文才，王丽萍

1)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院病理科 郑州 450052

肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，2018年全世界肺癌新发病例210万，死亡病例180万[1]。在中国，肺癌在恶性肿瘤中发病率及死亡率均居第一[2]。非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)占肺癌总发病数的87%，是最常见的肺癌亚型[3]。

依据NCCN治疗指南[4]，晚期NSCLC患者推荐采取以全身治疗为主的综合治疗。在NSCLC分子靶向治疗中，手术或穿刺组织癌基因突变的检测仍是“金标准”[5]。驱动基因是与肿瘤发生发展相关的重要基因，驱动基因的突变直接“驱动”肿瘤细胞。NSCLC常见驱动基因包括人表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)、鼠类肉瘤病毒致癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)、磷脂酰肌醇激酶-3催化亚基α(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit α,PIK3CA)、间质上皮转化因子(mesenchymal to epithelial transition factor,MET)等。由于肿瘤异质性很强[6]，不同肿瘤位点，甚至同一肿瘤位点不同肿瘤细胞的变异情况都可能不同[7]，单一病灶的基因检测结果不能反映体内肿瘤的整体特征。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)是释放入血的凋亡肿瘤细胞携带的肿瘤特异性基因，能够全面反映肿瘤组织的分子组成。Lebofsky等[8]在27例肿瘤匹配样品中证实29个突变中的28个可以在ctDNA中发现。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)如吉非替尼可以显著提高NSCLC患者的客观缓解率(objective response rate, ORR)和无进展生存期(progress free survival, PFS)[9-10]。携带EGFR敏感突变的NSCLC患者对EGFR-TKIs治疗反应较好，但大部分患者在接受治疗后9～13个月产生耐药[11]。随着新的靶向药物的产生和对耐药机制的深入研究，需要更全面地了解患者癌基因的组成信息，以指导治疗和评估疗效。本研究分析了晚期NSCLC患者外周血中与治疗相关的多种驱动基因及抑癌基因TP53的检测结果，探索基因突变状态及主要突变驱动基因ctDNA浓度与临床病理指标的关系，为晚期NSCLC的治疗提供依据。

1 对象与方法

1.1研究对象对于2018年6月至2018年12月郑州大学第一附属医院收治的NSCLC患者，根据纳入标准：①经病理或细胞学确诊为NSCLC，多次治疗后进展。②EGFR、ALK等基因突变，靶向治疗反应性差。③预期寿命至少为3个月。④临床分期Ⅲ～Ⅳ期，或同时经影像学、病史、检验等综合评估后考虑为晚期肺癌，并排除患有其他恶性肿瘤的患者，共纳入96例。96例中男51例，女45例；≤60岁47例，>60岁49例；23例有吸烟史，67例无吸烟史，6例吸烟史不详；腺癌70例，鳞状细胞癌(简称鳞癌)13例，其他(包括腺鳞癌、腺癌伴神经内分泌、未知等)13例；ⅢA期4例，ⅢB期15例，ⅢC期15例，Ⅳ期56例，不确定6例；ECOG评分1～2分35例，3～4分55例，不确定6例。回顾性分析患者外周血的基因检测结果。研究经我院伦理委员会批准，患者或家属均知情同意。

1.2外周血基因检测抽取患者外周血10 mL，离心取血浆。参照QIAamp循环核酸试剂盒(凯杰生物技术有限公司)提取血浆游离DNA，采用cSMART技术[12]对EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、ERBB2、BRAF、PIK3CA、MET和TP53共10种基因的常见变异进行检测，并检测上述基因ctDNA的浓度。所有实验在我院与福建和瑞基因科技有限公司的共建实验室内完成。

1.3统计学处理使用SPSS 22.0处理数据。采用χ2检验、Fisher确切概率法或两独立样本t检验比较不同临床病理特征的患者热点基因突变检出率以及EGFR ctDNA浓度的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1NSCLC外周血热点基因突变的检出情况所有患者基因突变的检出情况见图1。96例患者中有64例检出基因突变，占所有检测样本的66.7%，其中65.6%(42/64)突变发生在单个基因，其余34.4%(22/64)有2个基因以上发生突变。

57.1%(44/77)腺癌/腺癌伴神经内分泌癌和46.2%(6/13)鳞癌检测到热点基因突变，但两者相比，差异无统计学意义(χ2=0.544，P=0.461)。76.5%(26/34)Ⅲ期患者和92.9%(52/56)Ⅳ期患者检测到热点基因突变，但两者相比，差异亦无统计学意义(χ2=3.600，P=0.058)。

在检测的10个基因中，EGFR突变检出率最高，达44.8%(43/96)，其后依次是TP53、KRAS和PIK3CA，分别是14.6%(14/96)、10.4%(10/96)和9.4%(9/96)。MET基因14外显子跳跃突变检出4(4.2%)例，并且该突变独立于EGFR突变存在。ALK检出2例突变和1例EMLA4-ALK融合，占3.1%(3/96)。ERBB2突变检出2(2.0%)例，均为20号外显子A775_G776insYVMA。ROS1检出1(1.0%)例SLC34A2-ROS1融合。BRAF和RET基因突变未检测出。

图1 所有NSCLC患者外周血热点基因突变的检测结果

2.2不同临床病理特征患者EGFR、KRAS、TP53和PIK3CA突变检出率的比较结果见表1，可知不同年龄、性别，有无吸烟史，不同病理分型及分期，不同ECOG评分的NSCLC患者EGFR、KRAS、TP53、PIK3CA突变检出率差异均无统计学意义。

表1 EGFR、KRAS、TP53和PIK3CA突变检出率与NSCLC患者临床病理指标的关系 例(%)

*：病例数有缺失；△：校正χ2检验；#：确切概率

2.3EGFR基因突变患者药敏情况分析43例EGFR突变患者中，E19del检出率[58.1%(25/43)]最高，其次是T790M、L858R、L861Q、G719A和C797S，检出率分别为39.5%(17/43)、34.9%(15/43)、7.0%(3/43)、4.7%(2/43)和2.3%(1/43)。除了1例为单独突变之外，94.1%(16/17)T790M突变者同时检出E19del和(或)L858R突变。

43例EGFR突变的患者中，28(65.1%)例只检出EGFR突变，其中19例为单突变，9例有双重或三重突变。双重或三重突变中，L858R合并E19del 2例，E19del合并T790M 4例，L858R合并T790M 1例，L858R、19del和T790M 1例，19del、T790M和C797S 1例。除携带C797S的患者外，其他突变类型患者均对EGFR-TKIs治疗敏感。

43例EGFR突变患者中，还有15(34.9%)例为EGFR合并其他热点基因突变，其中合并KRAS突变2例，合并PIK3CA突变6例，此类突变对EGFR-TKIs治疗耐药。EGFR合并TP53突变7例，此类患者对EGFR-TKIs治疗的反应时间较短，会在短时间内出现耐药。

2.4不同临床病理特征患者外周血中EGFR ctDNA浓度的比较≤60岁年龄组外周血中EGFR ctDNA浓度高于>60岁年龄组，见表2。

表2 不同临床病理特征患者外周血中EGFR ctDNA浓度的比较

*：病例数有缺失

3 讨论

肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，它在基因组成上具有很高的异质性[13]。随着临床靶向治疗的开展，除一小部分患者本身就存在原发耐药，绝大多数患者在靶向药物治疗过程中都会不可避免地出现耐药。

研究[14]显示，不同分期的NSCLC患者外周血中ctDNA浓度不同，分期越高，ctDNA浓度越高，热点基因突变的检出率越高。本研究发现，Ⅲ期和Ⅳ期NSCLC患者热点基因突变率分别为76.5%和92.9%，与文献[15]报道的Ⅳ期NSCLC的外周血中热点基因突变率88%基本相符。

EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶受体，参与细胞的凋亡、增殖、侵袭和转移[16]。著名的PIONEER试验[17]结果显示亚裔肺腺癌患者EGFR突变率为51.4%。另外，众多研究发现，性别、吸烟与否、组织学类型与EGFR突变频率相关[17]，并且EGFR突变在不吸烟的女性患者中更常见[18]。本研究未观察到EGFR、KRAS、TP53和PIK3CA基因突变与性别、吸烟与否、组织学分型等病理指标的关系，这可能与入组的多为晚期患者，治疗史可能比较复杂，而且肿瘤本身存在较高的异质性有关。

研究[19]显示，一代EGFR-TKIs的耐药约50%是由EGFR基因T790M突变引起。另有研究[20]显示，从未接受过EGFR-TKIs治疗的患者中，大约1.38%可检出EGFR基因T790M突变，约2.45%可检出PIK3CA基因E545K突变，为原发耐药突变。在本研究中，所检测到的EGFR突变患者中有39.5%为T790M突变，而且此类患者同时存在其他EGFR突变，因此可以认为T790M是既往治疗诱导的耐药突变。

KRAS突变也是常见的EGFR-TKIs耐药机制，单纯EGFR突变患者总生存期34个月，而KRAS突变患者只有16个月[21]。PIK3CA突变发生在EGFR-TKIs治疗后耐药或无使用EGFR-TKIs指征的患者中[22]。据报道，10%～26%未吸烟的NSCLC患者存在TP53突变，TP53突变会降低患者对EGFR-TKIs治疗的反应时间[23]。另外，MET扩增或MET基因14号外显子跳跃突变、HER2扩增与突变、ROS1融合和ALK融合均是导致EGFR-TKIs耐药的机制[19，24-25]。本研究中，所检测到的EGFR突变患者中有34.9%伴随其他基因突变，如KRAS、TP53等，而这种共突变与EGFR存在交互作用，与EGFR-TKIs耐药的发生有关。

此外，本研究结果还显示≤60岁年龄组EGFR ctDNA浓度高于>60岁年龄组，提示年轻患者肿瘤组织中携带EGFR突变的肿瘤细胞多，肿瘤恶性程度高，这与年轻肺癌患者较老年患者进展更快相符。

综上所述，晚期NSCLC患者EGFR敏感突变合并耐药突变同时存在的比例较高，采取NSCLC相关的多基因联合液体活检，才能从整体上把握NSCLC患者的基因组成，找到最佳的治疗方案。