沉默ECT2对食管癌EC109细胞增殖、细胞周期和裸鼠成瘤能力的影响

刘 翼 ,祝 琳

1)西南医科大学附属医院消化内科 四川泸州 646000 2)西南医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科 四川泸州 646000

上皮细胞转化序列2(ECT2)是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子，在细胞周期调控过程中发挥着重要作用，与细胞增殖关系密切。越来越多的研究[1-4]发现，ECT2在非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌和子宫浆液性乳头状癌等多种肿瘤中异常高表达，在肿瘤细胞的增殖、转移和凋亡等生物学过程中发挥着重要的调控作用，是一个很有前景的肿瘤靶基因。尽管早期已有研究[5]发现，ECT2在食管癌组织中高表达，与患者的预后不良关系密切，发挥着促进食管癌细胞生长的作用，但其调控肿瘤细胞增殖的具体机制并不清楚，以ECT2为治疗靶点的实验依据还不够充足。因此，本研究采用shRNA介导的RNAi技术沉默ECT2，观察对食管癌细胞增殖和裸鼠成瘤能力的影响，旨在从细胞实验和动物实验探讨ECT2调控食管癌细胞生长的分子机制。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂EC109购于美国ATCC公司。BALB/c裸鼠33只(雌性，4～6周龄，体重23～25 g)购于上海斯莱克实验动物公司。GV148-shRNA-ECT2及其无效对照shRNA-NC慢病毒由苏州吉玛基因股份有限公司制备，shRNA-ECT2干扰序列为5’-GGACAUUAAAGUGGGCUUUTT-3’，shRNA-NC序列为5’-AGUACUGCUUACGAUACGGTT-3’。胎牛血清、胰蛋白酶购于美国HyClone公司，RPMI 1640培养基购于美国Gibco公司，CyclinD1、CDK2、ECT2和β-actin抗体购于英国Abcam公司，P21抗体购于美国Cell Signal公司，P53抗体购于美国Santa Cruz公司。辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 二抗购于中国中杉金桥公司，Trizol总RNA抽提试剂购于美国Invitrogen公司。CCK-8试剂盒和细胞周期检测试剂盒购于中国碧云天生物技术研究所，反转录试剂盒购于北京达科为生物公司，RT-PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司，RIPA蛋白裂解液和BCA法蛋白定量试剂盒购于中国碧云天生物技术研究所，PVDF膜购于美国Millpore公司。

1.2细胞培养于体积分数50%CO2、饱和湿度和37 ℃的细胞培养箱中以含有体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养EC109细胞。当细胞几乎铺满培养瓶底部时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。收集生长状态良好的EC109细胞进行后续实验。

1.3细胞分组与慢病毒感染实验分为对照组(未感染)、shRNA-NC组(感染shRNA-NC)和shRNA-ECT2组(感染shRNA-ECT2)。收集对数生长期的EC109细胞，胰蛋白酶消化制成浓度为2.5×106个/mL的细胞悬液。按照每孔500 μL细胞悬液平铺于6孔细胞板，置于细胞培养箱内培养过夜。弃原液后，向细胞中加入900 μL培养基、5 ng Polybrene和2×106TU慢病毒，感染48 h后，加入2 mg/L嘌呤霉素(筛选稳定转染的细胞)继续培养48 h后，收集细胞。

1.4RT-PCR检测ECT2mRNA的表达收集各组EC109细胞，加入Trizol总RNA抽提试剂提取总RNA。反转录合成cDNA，将cDNA作为模板，进行PCR扩增。20 μL总反应体系:2 μL cDNA、10 μL 2×SYBR Premix Ex Taq、上下游引物各0.4 μL、0.4 μL 50×ROX Reference Dye Ⅱ和6.8 μL ddH2O。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s 、62 ℃30 s，循环40次。由上海生工生物合成的ECT2引物上游：5’-GCCTTGCTTGTGAGGCCACCAA-3’，下游：5’-TCCACTGAGCCGTGGGATGTCA-3’；β-actin引物上游：5’-GGACCTGACTGACTACCTC-3’，下游：5’-TACTCCTGCTTGCTGAT-3’。以β-actin为内参，2-ΔΔCt法计算ECT2 mRNA的相对表达水平。

1.5CCK-8法检测细胞增殖收集各组EC109细胞，以每孔200 μL细胞悬液(浓度为2×104个/mL)接种于96孔细胞板，每组设4个复孔，另设一个空白调零孔(只加入等体积的培养基)，于培养箱内培养。培养至72和96 h后，加入10 μL CCK-8溶液常温反应2 h,采用酶标仪检测490 nm处的光密度(OD)值。实验重复3次。

1.6细胞周期检测收集各组EC109细胞，磷酸盐缓冲液洗涤后，胰蛋白酶消化制成浓度为2×104个/mL的细胞悬液，采用预冷的体积分数70%乙醇对细胞进行固定。以碘化丙啶染色后，上流式细胞仪进行检测。实验重复3次。

1.7裸鼠移植瘤实验收集各组细胞，制成浓度为1×106个/mL的细胞悬液。将33只雌性裸鼠随机分为3组，每组11只，分别将对照组、shRNA-NC组和shRNA-ECT2组细胞以每只0.5 mL注入裸鼠右后肢皮下。接种完毕后，将裸鼠放入SPF级动物房中饲养，观察成瘤情况。接种30 d后处死裸鼠，剥落移植瘤称重，并以精确到0.02 mm的游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，肿瘤体积=长径×短径2/2。取部分移植瘤组织，用于P21和P53蛋白的Western blot检测。

1.8目的蛋白的Western blot检测收集待测的EC109细胞和移植瘤组织，加入RIPA细胞裂解液于冰上裂解30 min提取总蛋白。按照BCA蛋白检测试剂盒说明书步骤测定总蛋白的浓度。将蛋白样品80 μg加入到120 g/L SDS-PAGE凝胶泳道孔中。电泳分离结束后，电转膜至PVDF膜上。将膜放入含50 g/L脱脂奶粉的封闭液中封闭1 h。加入以封闭液1∶1 000稀释的一抗(CDK2、CylinD1、ECT2、P21和P53)4 ℃孵育过夜。用1×TBST溶液洗膜10 min，3次后，加入封闭液1∶2 000稀释的二抗，常温孵育2 h。洗膜后加入化学发光剂。避光反应5 min，凝胶成像仪扫描拍照，Quantity One软件分析条带灰度值，以目的条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

1.9统计学处理采用SPSS 22.0分析，各组EC109细胞ECT2、CyclinD1、CDK2的表达和增殖活力，移植瘤体积、瘤体质量以及组织中P21和P53蛋白表达的比较使用单因素方差分析和SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组EC109细胞中ECT2的表达与对照组相比，shRNA-ECT2组细胞中ECT2蛋白和mRNA的表达水平明显降低，结果见图1和表1。

1：对照组；2：shRNA-NC组；3：shRNA-ECT2组

表1 3组EC109细胞中ECT2蛋白和mRNA的表达(n=3)

*：与对照组和shRNA-NC组比较，P<0.05

2.2 3组EC109细胞增殖活力和细胞周期与对照组和shRNA-NC组比较，shRNA-ECT2组细胞的增殖活力明显降低，G0/G1期细胞百分比明显升高，而S期细胞百分比降低，结果见表2。

表2 3组EC109细胞增殖活力和细胞周期的比较(n=3)

*：与对照组和shRNA-NC组比较，P<0.05

2.3 3组EC109细胞中CyclinD1和CDK2蛋白的表达shRNA-ECT2组细胞中CyclinD1和CDK2蛋白的表达水平较对照组和shRNA-NC组明显降低，结果见图2和表3。

1：对照组；2：shRNA-NC组；3：shRNA-ECT2组

表3 3组EC109细胞中CyclinD1和CDK2蛋白的表达(n=3)

*：与对照组和shRNA-NC组比较，P<0.05

2.4 3组细胞体内成瘤能力的比较接种3～7 d对照组和shRNA-NC组裸鼠均有肉眼可见的瘤体生成，在接种部位出现了逐渐变大的皮下小结节；而shRNA-ECT2组中仅有4只裸鼠瘤体生成，成瘤时间较对照组明显推迟了12 d。shRNA-ECT2组中瘤体体积和瘤体质量均明显减小，结果见表4。

2.5 3组裸鼠移植瘤组织中P21和P53蛋白的表达与对照组和shRNA-NC组相比，shRNA-ECT2组移植瘤组织中P21和P53蛋白的表达水平均明显升高，见图3和表5。

表4 3组细胞体内成瘤能力的比较

*：与对照组和shRNA-NC组比较，P<0.05

1：对照组 ；2：shRNA-NC组；3：shRNA-ECT2组

表5 3组裸鼠移植瘤组织中P21和P53蛋白的表达水平

*：与对照组和shRNA-NC组比较，P<0.05

3 讨论

近年来食管癌的发病率有明显升高的趋势，严重威胁着人们的身体健康[6-7]。食管癌细胞的恶性增殖是食管癌发生的重要基础，而此过程受到多种癌基因和抑癌基因的共同调控。深入探讨食管癌细胞增殖的调控机制，寻找能够抑制癌细胞增殖的有效靶点是治疗食管癌的重要策略。ECT2被认为是一种重要的癌基因，能够促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，与肿瘤的发生发展关系密切。ECT2在非小细胞肺癌组织中高表达，被认为是导致总体生存不良和复发的重要因素[8]。ECT2表达上调与肝癌早期复发和预后不良关系密切，敲除该基因可通过抑制Rho/ERK信号通路降低CyclinE/CDK2/Rb的活化，激活P53途径，抑制肿瘤细胞的增殖和转移，还能够在体内减缓肿瘤的生长[9]。ECT2是miRNA-223的靶基因，下调其表达可诱导P21表达，改变CyclinD1-CDK复合物的活性，导致细胞周期G1期发生阻滞，影响骨肉瘤细胞周期进展和增殖[10]。此外，ECT2还在肺腺癌、结直肠癌和胃癌等肿瘤中异常高表达，被作为肿瘤诊断和预后评估的重要标志物[11-13]。

本研究通过慢病毒GV148-shRNA-ECT2感染，成功沉默食管癌EC109细胞中ECT2表达后发现，EC109细胞的增殖活力明显减弱，这与Hirata等[5]早期发现下调ECT2表达可抑制食管癌TE9细胞增殖的结果相吻合。同时，本研究还发现沉默ECT2表达可使细胞周期阻滞于G0/G1期；进一步检测发现，在ECT2沉默的EC109细胞中CyclinD1和CDK2蛋白表达受到抑制。另外，通过建立食管癌裸鼠移植瘤模型发现沉默ECT2表达能够明显抑制移植瘤的生长，上调移植瘤组织中P21和P53蛋白的表达。已有研究[14-15]证实，P21和P53在食管癌细胞增殖过程中发挥着重要作用。P21和P53均是细胞周期依赖性激酶抑制剂，可通过调控G1/S转换的周期蛋白CyclinD1和CDK2的表达，使细胞周期阻滞于G1/G0期，进而抑制细胞增殖，发挥抗肿瘤作用[16-18]。本研究结果提示，沉默ECT2表达可通过促进P21、P53表达，进而下调CyclinD1、CDK2表达，影响细胞周期进展，抑制EC109细胞的增殖。

综上所述，沉默ECT2可抑制食管癌EC109细胞增殖和裸鼠成瘤能力，其作用机制可能与促进P21和P53的表达有关。该结果进一步丰富了ECT2调控食管癌发生发展的分子机制，也为以ECT2为靶点的食管癌治疗提供了新的实验依据。