T细胞可诱导共刺激分子配体胞外段基因的克隆与表达

汲 翔，郭 勋，范丹丹，康巧珍，袁维堂

1)郑州大学第一附属医院肛肠外科 郑州 450052 2)郑州大学生命科学学院 郑州 450001 3)郑州大学河南省医药科学研究院肿瘤研究所 郑州 450052

T细胞可诱导共刺激分子(inducible co-stimulator, ICOS)及其配体(ICOS ligand, ICOSL)是近年来发现的B7/CD28家族成员[1]。ICOSL又名B7h、B7-H2，最早在研究鼠cDNA文库时分离获得，在正常生理状态下低水平表达于B细胞表面，通过与T细胞的ICOS相互作用，构成ICOS/ICOSL信号通路，主要调控T细胞的活化、Th1/Th2细胞亚群分化等[2-3]。ICOSL在炎症性疾病、肿瘤和自身免疫性疾病中发挥重要的免疫调节作用[4-5]。有研究[6]表明ICOSL在多种肿瘤细胞中高表达，与肿瘤细胞的免疫逃逸密切相关。还有报道[7-8]表明，使用单克隆抗体阻断ICOS/ICOSL信号通路会下调T细胞表面活化标志物CD69和CD25表达，减少IL-4和IFN-γ细胞因子的产生，抑制小鼠红斑狼疮疾病模型的发展。但该信号通路在抗肿瘤免疫和自身免疫疾病中的分子机制还有待深入研究。克隆ICOSL胞外段(ICOSL-N)基因并获得重组融合蛋白不仅为研究ICOS/ICOSL信号通路在T细胞活化调控中的功能机制提供分子模型，还将为肿瘤免疫治疗提供新思路。本研究利用生物信息学软件设计ICOSL-N和IgG4基因引物，采用RT-PCR法从小鼠脾脏中克隆目的基因ICOSL-N，通过基因工程技术构建原核重组质粒pET22b-ICOSL-N-Ig，获得ICOSL-N-Ig重组蛋白，为ICOS/ICOSL信号通路机制研究及免疫调节药物研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料大肠杆菌DH5α、感受态细胞E.coliBL21(DE3)、限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、RNAiso Plus试剂盒购自大连宝生物公司，Pfu Master Mix试剂购自北京康为世纪生物公司，反转录试剂盒购自美国赛默飞世尔科技公司，质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购自美国Genview 公司，DNA产物纯化试剂盒购自北京索莱宝生物有限公司，pET22b(+)载体购自大连宝生物公司，人源IgG4重链Fc基因模板为实验室保存。

1.2引物设计与合成搜索NCBI中GenBank数据库和UniProt蛋白数据库，查询小鼠ICOSL和人源IgG4编码基因序列，采用Primer 5软件设计ICOSL-N和IgG4基因PCR上下游引物序列。利用重叠延伸PCR设计原理和选取的酶切位点，在ICOSL-N的上游引物插入NdeⅠ酶切位点，IgG4基因下游引物插入XhoⅠ酶切位点，同时分别在ICOSL-N下游引物和IgG4上游引物插入柔性链接子(GGGS)3。ICOSL-N上游引物：5’-CCGCATATGCTCATCATTGGCTTTGGC-3’；下游引物：5’-AGAACCGCCACCGCCGGAGCCACCGCCACCAGATCCGCCACCGCCCTCATTATTGTGGGTTTCCT-3’。IgG4上游引物：5’-GGCGGTGGCGGATCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGCTGAATCTAAGTACGGTCCA-3’，下游引物：5’-GGGCCCTCGAGACCAAGACTTAATGAAAG-3’。划线部分为酶切位点，加粗部分为柔性链接子(GGGS)3序列。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3PCR模板制备选取8周龄SPF级C57BL/6小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，颈椎脱臼法处死小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏组织50 mg，按照RNAiso Plus试剂盒说明书操作，提取总RNA，定量取1 μg 总RNA，反转录(42 ℃60 min，70 ℃5 min)获得模板cDNA，-20 ℃保存备用。

1.4ICOSL-N和人源IgG4基因克隆以保存的C57BL/6小鼠脾脏cDNA和人源IgG4基因为模板，采用ICOSL-N和IgG4上下游引物分别进行PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，29个循环；72 ℃6 min。收集PCR产物，利用DNA 产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，4 ℃保存。

1.5ICOSL-N-Ig融合基因的制备采用PCR重叠延伸技术，即在ICOSL-N下游引物和IgG4上游引物扩增过程中，重叠链(GGGS)3延伸，目的基因ICOSL-N和IgG4 连接后得到融合基因ICOSL-N-Ig片段。分别取2 μL ICOSL-N和2 μL IgG4的PCR纯化产物，加入ICOSL-N上游引物2 μL、IgG4下游引物2 μL、Pfu Master Mix 25 μL、ddH2O 17 μL后进行PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，29个循环；72 ℃6 min。取5 μL PCR产物，经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定，电压120 V，时间30 min，凝胶图像分析仪观察记录实验结果。

1.6pET22b-ICOSL-N-Ig原核表达质粒的构建按照质粒小提试剂盒说明书提取pET22b(+)空质粒，融合基因片段与pET22b(+)质粒用NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切，37 ℃反应3 h。回收双酶切产物，T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接。常规转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行双酶切与测序鉴定。

1.7融合蛋白的诱导表达与鉴定将测序正确的阳性重组质粒pET22b-ICOSL-N-Ig转化至原核表达菌株BL21(DE3)，接种环挑取单菌落至含氨苄青霉素的LB培养基内，200 r/min、37 ℃过夜振荡培养。次日以体积比1∶100转接于新鲜的LB培养基中，200 r/min、37 ℃培养。利用分光光度计检测600 nm处的光密度(OD)值，当OD值达到0.6(对数生长期)时，加入诱导剂0.4 mmol/L IPTG 37 ℃诱导培养4 h，收集菌液，9 000 r/min离心5 min，收集菌体沉淀物，-20 ℃保存。用可溶性平衡缓冲液(300 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L咪唑、10 mmol/L Tirs，pH 8.0)重悬菌体后超声破碎，然后离心收集沉淀和上清。以BL21(DE3)和pET22b 空质粒作为阴性对照。SDS上样缓冲液处理样品，120 g/L SDS-PAGE电泳分析融合蛋白表达情况。

2 结果

2.1ICOSL-N基因的克隆及与IgG4基因的体外融合PCR分别扩增出ICOSL-N与IgG4基因序列后，利用PCR重叠延伸技术扩增，得到符合理论值1 425 bp的基因条带(图1)，表明成功制备融合基因ICOSL-N-Ig。

M：DNA Marker；1：ICOSL-N-Ig；2：ICOSL-N；3：IgG4

2.2pET22b-ICOSL-N-Ig原核表达质粒的鉴定阳性克隆双酶切鉴定结果(图2)显示，目的基因条带符合理论预期大小(1 425 bp)，与ICOSL-N-Ig片段大小一致，表明成功构建了pET22b-ICOSL-N-Ig原核表达质粒。

M：DNA Marker；1：pET22b-ICOSL-N-Ig双酶切结果

2.3pET22b-ICOSL-N-Ig测序结果将双酶切鉴定符合预期的阳性克隆进行测序，将测序结果与NCBI数据库中小鼠ICOSL-N基因序列进行在线比对，结果与数据库中ICOSL-N及IgG4基因一致，证实成功构建了ICOSL-N-Ig基因融合表达的重组质粒。

2.4融合蛋白的诱导表达SDS-PAGE结果(图3)显示，ICOSL-N-Ig以包涵体形式存在于菌体中，在53 800处可见明显的条带，且与目标蛋白的大小基本一致，表明融合蛋白ICOSL-N-Ig成功诱导表达。

M：蛋白Marker；1：BL21(DE3)菌体沉淀物；2：BL21(DE3)菌体上清

图3重组蛋白SDS-PAGE电泳图谱

3 讨论

T细胞是获得性免疫应答的主要识别和效应细胞，其活化调控与机体抗感染、抗肿瘤及自身免疫疾病的发生密切相关。T细胞活化受两种信号调控：第一信号是由T细胞受体(T cell receptor, TCR)与抗原肽-MHC复合物相互作用启动；第二信号是ICOS与ICOSL结合形成的辅助信号。ICOS是表达于T细胞表面的一类跨膜糖蛋白，其与ICOSL结合不仅能增强T细胞与抗原递呈细胞的连接，促进TCR与抗原肽-MHC复合物的结合，还能向T细胞传递完全活化所必需的辅助信号，参与T细胞增殖、分化及免疫功能的调控[1]。

目前已经发现的T细胞ICOS/ICOSL有很多种，包括CD28/B7、CD40/CD145、Fas/FasL、OX40/OX40L、4-1BB/4-1BBL[9-11]等。B7家族ICOS是由结构相关的细胞表面蛋白组成，通过与其受体相结合提供共刺激或共抑制信号来调节免疫应答[2]。本研究通过查询GenBank数据库和UniProt蛋白数据库得到了T细胞ICOSL-N基因序列，利用基因工程技术将鼠源ICOSL-N基因与人源IgG4重链Fc恒定区蛋白进行融合，成功构建了原核表达质粒pET22b-ICOSL-N-Ig。IgG4的引入为利用融合蛋白ICOSL-N-Ig开展免疫调节功能与机制的体内外研究奠定了基础。

本研究选用经典的大肠杆菌原核表达系统获得目的基因融合蛋白。原核表达系统具有操作简单、成本低廉且易用于产业化推广等优点，但在蛋白诱导表达过程中易出现包涵体。包涵体的形成受多因素影响，本实验中诱导表达的ICOSL-N-Ig融合蛋白就是以包涵体形式存在，后续将会继续开展融合蛋白表达体系的优化及蛋白纯化工艺研究。