鸢尾素对抑郁小鼠行为学、外周血CD4+细胞Th17分化和糖酵解的影响

马明逸，余 列，秦 波

1)郑州大学第一附属医院神经内一科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院转化医学中心 郑州 450052

抑郁症又称为抑郁障碍，是精神科十分常见的疾病，全世界约3.22亿患者，且患者人数在逐年增加[1-3]。因该类患者劳动力减弱且需长期或终身服药，给个人、家庭及社会带来沉重的负担[4],但目前的治疗手段不多且疗效欠佳。近期的研究[5-6]提示，以Th17细胞增多为特征的免疫系统紊乱可能是抑郁症的重要发病机制。因此，抑制Th17细胞形成逐渐成为抗抑郁的研究热点。Th17细胞来源于初始CD4+T细胞，以分泌IL-17A为特征。研究[5]发现Th17细胞分化形成及功能执行过程中的代谢模式偏好于糖酵解。抑制初始CD4+T细胞的糖酵解能有效减少Th17细胞的形成[7]。鸢尾素是于2012年被发现的一种运动激素，通过调控细胞代谢发挥生理学作用，参与多种病理生理过程[8]。目前的研究主要探讨了鸢尾素对肝细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、神经元等细胞功能的影响[8-10]，尚无研究探讨其对免疫系统是否具有调节作用。本研究观察了鸢尾素对抑郁小鼠CD4+T细胞糖酵解和Th17分化的影响，探讨其是否可通过调控CD4+T细胞的代谢，抑制Th17细胞的形成，发挥抗抑郁作用。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器兔抗小鼠丙酮酸激酶2(pyruvate kinase subtype M2,PKM2)多克隆抗体购自美国Abcam公司，CD4-PerCP、CD62L-APC、CD44-FITC、CD25-PE、IL-17A-APC抗体购自德国美天腻公司，CD3、CD28、IL-4、IFN-γ抗体购自美国BD公司。淋巴细胞分离液、乳酸含量测定试剂盒及丙酮酸含量测定试剂盒购自北京索莱宝公司。IL-17A ELISA 检测试剂盒，IL-6、TGF-β1、IL-1β、IL-23及重组鸢尾素蛋白购自美国R&D公司。旷场行为检测系统购自上海赞德公司，强迫游泳装置购自江苏塞昂斯公司，FACSCelesta流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2实验动物10～12周龄BALB/c雄性小鼠购自河南省实验动物中心，合格证号:SYXK(豫)2011-0001。单笼饲养，环境温度(22±1) ℃，湿度(55±5)%，12 h/12 h昼夜节律，自由摄食饮水。

1.3抑郁模型的制备及实验分组将小鼠按照20 mg/(kg/d)的剂量腹腔注射皮质醇，4周后采用糖水偏好实验评价抑郁模型是否成功[6]。将造模成功的小鼠分为2组，模型组和鸢尾素组，每组6只。正常对照组小鼠6只不造模。鸢尾素组小鼠按照100 μg/kg腹腔注射重组鸢尾素，正常对照组和模型组注射等体积的生理盐水[8]，连续6 d。

1.4小鼠抑郁行为的观察

1.4.1 糖水偏好实验 于末次腹腔注射皮质醇后第2天进行。在笼子的左右角分别放置10 g/L蔗糖水1瓶和纯水1瓶，1 h后测量2瓶液体质量变化。糖水偏好度=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%。

1.4.2 旷场实验 糖水偏好实验完成后隔天进行旷场实验。测试箱的规格为50 cm×50 cm×40 cm，底部黑色，四壁白色。将小鼠面朝箱壁放入测试箱内的某一角落，采集小鼠10 min内旷场中心区的运动时间及进入中心区的次数。实验完毕后，清理测试箱，乙醇消毒、通风后进行下只小鼠的测试。每只小鼠实验1次。

1.4.3 强迫游泳实验 旷场实验完成后进行强迫游泳实验。向玻璃圆缸内加入25 ℃左右的纯净水至20 cm刻度。放入小鼠后使用系统自带视频采集软件采集小鼠活动影像6 min，记录后4 min内的不动时间。完成实验后，更换测试器内温水后进行下只小鼠的测试。每只小鼠实验1次。

1.5小鼠外周血中Th17细胞比例及IL-17A含量的测定

1.5.1 外周血单个核细胞的收集 所有行为学实验完成后，小鼠眼眶静脉采血1～2 mL，抗凝，加入等体积的RPMI 1640培养基充分混匀，加2 mL淋巴细胞分离液1 500 r/min离心15 min，收集白膜层后用PBS清洗2次，1 800 r/min 离心10 min，收集沉淀(单个核细胞)备用。

1.5.2 指标检测 ①Th17细胞比例：取含有106个细胞的单个核细胞悬液，加入PBS并定容至100 μL，分别加入CD4和IL-17A抗体，充分混匀后，4 ℃避光保存45 min；加入1 mL PBS，2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入200 μL PBS后上流式仪检测CD4+IL-17A+细胞比例。②IL-17A含量：收集小鼠外周血，按照检测试剂盒说明书操作，检测外周血中IL-17A的含量。

1.6鸢尾素处理后小鼠初始CD4+T细胞Th17分化及糖酵解的变化

1.6.1 正常小鼠初始CD4+T细胞的分选及分组 颈椎脱臼处死正常小鼠并用体积分数75%乙醇浸泡2 min，分离、收集两侧腹股沟处淋巴结，充分剪碎后用研杵研压，加入适量RPMI 1640培养液， 400目筛网过滤，收集细胞悬液并调整细胞浓度为104个/μL。采用CD4/CD62L/CD44/CD25染色方案，通过流式细胞分析仪获取CD4+CD62LhighCD44lowCD25-初始CD4+T细胞[7]。实验设对照组和鸢尾素组。将正常小鼠初始CD4+T细胞按106个/mL加入到12孔板，同时给予Th17细胞分化条件刺激：CD3 抗体(1 mg/L)，CD28 抗体(1 mg/L)，IL-4 抗体(10 mg/L)，IFN-γ抗体(5 mg/L)，IL-6(50 μg/L),TGF-β1(10 μg/L)，IL-1β(10 μg/L)，IL-23(50 μg/L)[7]。刺激3 d后鸢尾素组加入鸢尾素(500 μg/L)继续培养3 d，对照组加入等体积PBS。

1.6.2 Th17细胞分化率的检测 分组处理完成后，检测CD4+IL-17A+细胞比例，方法同1.5.2。

1.6.3 细胞内丙酮酸和乳酸含量的测定 分组处理完成后，每组分别收集细胞5×107个，按照检测试剂盒说明书操作，检测丙酮酸含量和乳酸含量。

1.6.4 细胞内PKM2蛋白表达的检测 分组处理完成后，每组分别收集细胞107个，加入1 mL裂解液，反复吹打至无细胞沉淀，14 000 r/min离心3 min，取上清液分装保存。采用Western blot法检测PKM2蛋白表达。配制100 g/L分离胶和40 g/L浓缩胶；每孔蛋白上样量50 ng，电泳(分离胶80 V，浓缩胶120 V)，转膜(14 V)2 h后封闭1 h，加入PKM2抗体(1∶1 000)孵育过夜，加二抗(1∶500)室温孵育1 h，加入化学发光液处理后拍照观察，采用Image J 10分析。目的蛋白相对表达量以目的条带与内参GAPDH条带灰度值的比值表示。

1.7统计学处理采用SPSS 17.0处理数据。3组小鼠旷场中心区运动时间及进入次数、糖水偏好度、强迫游泳不动时间、外周血中Th17细胞比例及IL-17A含量的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。两组细胞Th17细胞分化率，丙酮酸、乳酸含量及PKM2表达水平的比较采用两独立样本的t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组小鼠抑郁行为的变化见表1。与正常对照组比较，模型组小鼠旷场中心区运动时间缩短，旷场中心区进入次数减少，糖水偏好度降低，强迫游泳不动时间延长(P<0.05)。与模型组比较，鸢尾素组小鼠旷场中心区运动时间延长，进入次数增加，糖水偏好度增加，强迫游泳不动时间缩短(P<0.05)。

2.2 3组小鼠外周血中Th细胞比例及IL-17A含量的比较见表1。与正常对照组比较，模型组小鼠外周血中Th17细胞比例和IL-17A含量增高(P<0.05)。鸢尾素组小鼠外周血中Th17细胞比例及IL-17A含量均较模型组降低，但仍高于正常对照组。

2.3鸢尾素对小鼠初始CD4+T细胞Th17分化及糖酵解的影响Western blot结果见图1。两组Th17细胞分化率、丙酮酸和乳酸含量以及PKM2表达水平的比较见表2。与对照组比较，鸢尾素组Th17细胞分化率下降，细胞内丙酮酸、乳酸含量及PKM2表达水平降低(P<0.05)。

表1 3组小鼠旷场中心区运动时间及进入次数、糖水偏好度、强迫游泳不动时间的比较

*:与正常对照组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05

图1 两组细胞中PKM2蛋白的表达

表2 两组Th17细胞分化率、丙酮酸和乳酸含量及PKM2表达水平的比较

3 讨论

抑郁症是严重危害人类健康的身心疾病[3]。关于其发病机制目前存在多种假说，其中免疫炎症假说是最受关注的理论之一。该理论的核心部分是机体内环境改变导致Th17细胞形成增多，该类细胞通过释放IL-17A等细胞因子，介导炎症反应，促进抑郁症的发生发展。因此，阻断Th17细胞的形成可能是具有良好应用前景的抗抑郁药物的开发策略[5,9]。

研究[8-11]发现鸢尾素具有调节代谢、抗动脉粥样硬化等功能，但关于鸢尾素抗抑郁的研究处于起步阶段[11]。本研究以抑郁小鼠模型为研究对象，观察了鸢尾素对抑郁小鼠行为学、外周血Th17细胞比例和IL-17A水平的影响。在抗抑郁的研究中，国外学者[8，11]主要采用脑室内单次低剂量注射鸢尾素的方式给药。由于鸢尾素主要由骨骼肌分泌，长期规律运动才具有抗抑郁作用[8]，所以本研究采用连续腹腔注射的方式给药，以使小鼠体内鸢尾素水平的变化更加接近生理状态。本研究结合糖水偏好度实验、旷场实验及强迫游泳实验证实了鸢尾素可改善抑郁小鼠的快感缺失、自发活动减少、行为绝望等行为，具有抗抑郁作用，同时抑郁小鼠外周血Th17细胞比例和IL-17A水平也下降，提示其作用机制可能与减少小鼠外周血中Th17细胞形成有关。

代谢调控是细胞分化发育的关键因素之一。Th17细胞来源于初始CD4+T细胞。在内环境利于糖酵解的代谢模式下，CD4+T细胞通过糖酵解模式供能，分化形成Th17细胞并分泌IL-17A等炎症介质，抑制糖酵解的关键酶活性可阻断Th17细胞形成[6-7]。既往研究[8,10-11]提示鸢尾素可通过上调葡萄糖转运蛋白4、解偶联蛋白1或下调葡萄糖-6-磷酸酶等的表达影响糖代谢并调控糖酵解。丙酮酸激酶是糖酵解的限速酶之一，其通过分解磷酸烯醇式丙酮酸产生丙酮酸，在无氧条件下最终形成乳酸，因此细胞中丙酮酸和乳酸含量可较好地反映糖酵解程度[7]。此外，在免疫细胞中，主要由PKM2调控糖酵解过程。本研究发现，鸢尾素可显著降低正常小鼠初始CD4+T细胞的Th17细胞分化率，在此过程中细胞中丙酮酸和乳酸含量降低，PKM2表达下调；说明鸢尾素可能通过抑制PKM2的表达降低初始CD4+T细胞糖酵解水平，最终影响其向Th17细胞分化。

综上所述，鸢尾素可通过调控CD4+T细胞的代谢，抑制Th17细胞的形成，从而减少IL-17A的分泌，发挥抗抑郁作用。这为抑郁症的治疗提供了新思路。关于鸢尾素调控PKM2表达的相关分子机制还需要进一步研究。