非小细胞肺癌组织中Foxp3、PD-1和CD45RO蛋白的表达

尹 婕，何志昂，张 毅，王丽萍

1)郑州大学第一附属医院肿瘤中心 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州 450052 3)河南省肿瘤免疫与生物治疗重点实验室 郑州 450052

肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，严重威胁人类健康[1]，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的85%[2]。虽然目前治疗手段不断提高，但由于多数NSCLC患者发现较晚且出现远处转移，预后较差,因此亟待探索影响患者预后的相关因素。随着对肿瘤免疫微环境研究的不断深入，影响肿瘤细胞生长、进展以及侵袭性的多种机制和途径逐渐被揭示[3]。目前研究[4-5]发现表达叉头框蛋白3(forkhead box protein 3, Foxp3)和程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1, PD-1)等免疫抑制标志物的细胞在肿瘤逃逸机制中发挥关键作用。Foxp3被认为是调控T细胞分化和功能的关键因子；研究[6-7]表明，Foxp3与NSCLC患者不良预后有关。PD-1是一种重要的免疫抑制因子，其表达与CD8+T细胞的功能障碍有关，可造成T细胞耗竭[8-9]；已证明[10]PD-1抑制剂可治疗部分NSCLC患者，且疗效显著。CD45分子又称白细胞共同抗原，在淋巴细胞的发育成熟、功能调节及信号传导过程中发挥重要作用，其亚型由3种不同的外显子(A、B和C)选择性链接而成，其中缺乏3个外显子的亚型称为CD45RO，是区分原始T细胞和记忆T细胞的重要标志[11]。有研究[12]表明，肺癌患者肿瘤浸润淋巴细胞CD45RO多为高表达，但其与患者预后的关系有待探讨。本研究观察了NSCLC患者肿瘤组织中免疫抑制标志物Foxp3、PD-1和记忆性T细胞标志物CD45RO的表达情况，并探讨三者的表达与临床病理因素及患者预后的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象收集2009年9月至2010年8月郑州大学第一附属医院胸外科收治的87例NSCLC手术患者的肿瘤组织。男67例，女20例，其中57(65.5%)例有吸烟史。年龄37～83岁，中位年龄60岁。48例为鳞状细胞癌(简称鳞癌)，39例为腺癌；73例患者肿瘤直径>5 cm，14例≤5 cm；47例发生淋巴结转移；高、中、低分化依次为9、67和11例；TNMⅠ、Ⅱ、Ⅲ期分别为11、32、44例。另外收集18例NSCLC手术患者的癌旁正常组织(距癌组织≥5 cm且经病理证实)和20例良性病变患者切除的正常肺组织作为对照。该研究经医院伦理委员会批准。所有组织均经过患者知情同意后收集，并且经过病理医师再次审阅并明确诊断。

1.2不同组织中PD-1、Foxp3和CD45RO蛋白表达的检测鼠抗人PD-1、鼠抗人CD45RO单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，使用时均按1∶100稀释，鼠抗人Foxp3单克隆抗体购自美国BD公司，使用时按1∶50稀释，免疫组化试剂盒购自美国Thermo Scientific公司。取石蜡包埋组织，4～5 μm厚切片，采用免疫组化SP法分别检测PD-1、Foxp3和CD45RO的表达情况，以已知阳性切片为阳性对照，以PBS代替一抗为阴性对照，具体操作方法参照试剂盒说明。采用Olympus光学显微镜和计算机图像分析系统采集图像，选择组织结构清晰且染色均匀的切片进行定量分析。PD-1、Foxp3和CD45RO阳性显色均为棕黄色颗粒，PD-1主要在胞质和胞膜中表达，Foxp3和CD45RO在核仁、胞质和胞膜中均有表达。由两名研究人员分别选择5个独立视野(×400)进行双盲阅片。计算阳性细胞百分比。阳性细胞百分比<1%为0分，1%～为1分，11%～为2分，>50%为3分；染色强度：无染色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分。最终将两项评分相乘得到免疫反应评分，>5分为高表达，<5分为低表达[13]。

1.3随访87例NSCLC患者均获随访，开始随访时间为2009年10月，末次随访时间为2013年12月，随访终点为患者术后出现疾病进展或死亡，无进展生存期(progression-free survival, PFS)定义为患者自接受手术开始到出现明确疾病进展的时间。

1.4统计学处理采用SPSS 19.0处理数据。采用χ2检验比较不同临床病理因素的NSCLC组织中上述3种蛋白表达的差异。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并行log-rank检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1NSCLC组织与对照组织中PD-1、Foxp3和CD45RO的表达在肿瘤组织和对照组织中，CD45RO的表达水平相似，而 PD-1和Foxp3则在肿瘤组织中高表达，见图1和表1。

A:PD-1的表达;B:CD45RO的表达;C：Foxp3的表达;1：低表达；2：高表达

表1 不同组织中3种蛋白表达的比较 例(%)

*:校正χ2检验

2.2Foxp3、PD-1及CD45RO的表达与NSCLC临床病理因素的关系CD45RO几乎在所有肿瘤组织和对照组织中均有表达，其在肿瘤组织中的高表达与淋巴结转移有关，Foxp3高表达与淋巴结转移和分化程度有关，PD-1高表达与各临床病理因素均无关(表2)。

表2 不同临床病理特征NSCLC肿瘤组织中Foxp3、PD-1及CD45RO表达的比较

续表2

2.3不同Foxp3、PD-1和CD45RO表达水平的NSCLC患者的生存分析患者无进展生存曲线见图2，可见Foxp3高表达的患者预后较差(χ2=4.320，P=0.042)。

图2 不同Foxp3(左)、PD-1(中)和CD45RO(右)表达水平患者的生存曲线

3 讨论

本研究结果显示，PD-1和Foxp3在NSCLC组织中高表达，提示二者可能参与NSCLC的发生。Fu等[14]的研究认为Foxp3的表达与NSCLC患者TNM分期及淋巴结转移情况密切相关。本研究结果显示，有淋巴结转移和低分化组织中Foxp3高表达率更高，且Foxp3高表达的患者预后更差。有报道[15]表明在其他恶性肿瘤如人乳头瘤病毒相关的头颈癌中，PD-1阳性表达者较阴性表达者具有更好的预后，在滤泡性淋巴瘤中亦有类似结果[16]。但与预期不同的是，本研究发现NSCLC组织中PD-1高表达与患者的临床病理参数和无进展生存期无关，推测可能是由于本项目收集的样本量相对较少，下一步拟继续扩大样本量进行重复验证。

此外，本研究还观察了记忆性T细胞标志物CD45RO的表达情况，发现其在NSCLC组织和正常组织中的高表达率差异无统计学意义，但其在有淋巴结转移的NSCLC患者肿瘤组织中高表达。在其他肿瘤中，Chen等[17]则证明CD45RO阳性与结直肠癌患者的生存正相关，谭莉霞等[18]亦有相同发现。

综上所述，Foxp3和PD-1在NSCLC组织中高表达；Foxp3在有淋巴结转移和分化程度低的NSCLC组织中高表达，且与患者不良预后有关；PD-1表达与患者的临床病理参数和PFS尚未证明有明显相关性；CD45RO表达与淋巴结转移相关，但与患者的其他临床病理参数和预后无关。