慢性阻塞性肺疾病动物模型的造模方法

刘 迪，张洪春

(1.北京中医药大学，北京 100029； 2.中日友好医院肺病科 中日友好医院呼吸中心 国家呼吸疾病临床研究中心，北京 100029)

慢阻肺是一种常见的慢性气道炎症性疾病，病理学特征为小气道重塑和肺气肿，患者主要表现为气流受限及持续性呼吸道症状(咳嗽、咳痰、气喘等)，暴露于有毒颗粒及气体中是与发病最相关的环境诱因[1]。慢阻肺发病机制主要与气道和肺部炎症、氧化-抗氧化失衡及蛋白酶-抗蛋白酶失衡相关[2]，其中炎症在慢阻肺发展中起最重要作用，多机制共同作用造成小气道狭窄、肺实质破坏，最终造成肺弹性回缩能力下降[3]。

2018年对中国十个省份57 779人的慢阻肺调查显示：中国40岁以上人群慢阻肺患病率为13.7%，60岁以上人群患病率已超过27%。男性患者数为女性的2.2倍。全国总患病人数为9990万，约占全球慢阻肺患者的25%，慢阻肺已经成为我国最常见的慢性疾病，对社会造成沉重负担[4]。慢阻肺自2000年以来排在全球死亡原因第四位，全球疾病负担(global burden of disease, GBD)研究预计到2020年慢阻肺将成为全球死因第三位[5]。尽管进行了广泛的研究，但在分子水平上对慢阻肺的潜在机制仍知之甚少，因此目前尚无有效治疗药物，指南推荐稳定期患者吸入长效支气管扩张剂以维持治疗[1]。

动物模型对于进一步研究人类慢阻肺相关机制很有价值，建立稳定可靠并与临床实际相符的动物模型是实验成功的前提。基于此，本文结合文献检索和回顾性研究，对慢阻肺动物模型的动物种类及造模方法进行总结，这些信息对于选择合适的动物，诱导方法和有关慢阻肺研究的主要测量参数有一定参考价值。

1 慢阻肺动物模型相关文献检索

1.1 检索方法

以“animal model” “COPD” “emphysema” “chronic bronchitis”等为关键词，检索2016年9月1日至2019年9月1日PubMed数据库收录的文献。纳入进行慢阻肺动物造模，叙述造模具体方法，提供造模后模型评价参数并可获取全文的英文文章。

1.2 检索结果

最终纳入符合要求的研究有164项，具体有170条造模方法(6项研究采用了两种造模方法)。慢阻肺造模的模型动物主要为小鼠、大鼠、豚鼠，少部分用兔、猴、雪貂等。大部分研究采用单一方法造模，主要通过暴露于香烟烟雾(cigarette smoke, CS)，气管内脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和鼻内弹性蛋白酶如猪胰弹性蛋白酶(porcine pancreatic elastase, PPE)滴注诱导造模；复合方法种类较多，多由单一造模方法联合而成。造模评价主要测量参数为肺组织病理数据、肺部炎症细胞和炎症介质，少部分研究测量了肺功能、动脉血气分析、肺部影像学等。

1.2.1 采用单一方法制作慢阻肺动物模型的研究

从造模方法来看，共有122项研究，126种动物模型采用单一方法造模，方法主要分为两种：将动物暴露在诱导气体中及鼻内、气管内滴注或腹腔注射诱导剂。

共有90种动物模型通过将动物暴露在有毒有害气体，如CS、臭氧、二氧化氮(nitrogen dioxide, NO2)、生物质燃料(biomass fuel, BMF)、机动车尾气(motor vehicle exhaust, MVE)、大麻烟雾等中产生。其中79种动物模型采用CS暴露诱导，使用的动物包括：小鼠(57种)，大鼠(16种)，豚鼠(4种)，兔(1种)[6]，雪貂(1种)[7]；大部分采用在密闭容器内将动物全身长时间暴露于CS中造模，但暴露的剂量及频次均不统一，暴露时间最长为40周，最短的为3 d；大部分研究进行了肺组织切片染色、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)收集及检验，少部分研究测量了动物肺功能；造模目的主要包括造模方法间比较，新的造模方法评价，发病机制、干预靶点研究，CS暴露对其他脏器影响，药物治疗，诊断等。6种动物模型由暴露于臭氧中诱导产生，选用的动物包括：小鼠(5种)，大鼠(1种)，大部分研究采用慢性暴露于臭氧中造模。2项研究采用慢性NO2干预大鼠制作慢阻肺动物模型。1项研究模型通过分别将大鼠慢性暴露于BMF和MVE中产生并探究其发病机制[8]。1项研究使用大麻烟雾造模并对模型进行了评价[9]。

26种动物模型采用气管内或鼻内滴注PPE诱导而成，采用的动物包括：小鼠(24种)，大鼠(2种)；大部分采用单次滴注PPE，少部分研究采取多次滴注[10]。6种动物模型选用香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)诱导而成，造模的动物包括：小鼠(5种)，大鼠(1种)；干预方式有多次腹腔注射、连续3周气管内滴注、连续2周雾化吸入CSE溶液等。4种模型采用小鼠鼻内滴注LPS方法造模，其中Almeida等[11]采用第1、3天滴注两次急性造模和每周两次滴注，持续20周的方法慢性造模，以研究干细胞分别对LPS急慢性暴露后肺损伤的治疗作用。

1.2.2 采用复合方法制作慢阻肺动物模型的研究

从造模方法来看，共有42项研究，44种动物模型采用复合方法造模，复合方法造模多是为了制作慢阻肺加重期动物模型，通过CS、LPS、PPE等诱导剂使模型动物产生肺气肿样病变，再联合PM2.5急性暴露、接种细菌或病毒等使病情急性加重。

CS联合LPS是最常使用的方法，共有22种动物模型通过此法制得，其中小鼠模型(3种)，大鼠模型(19种)，大部分采用慢性暴露于CS中联合多次气管内滴注LPS诱导产生。有8项研究采用CS或PPE暴露后在模型动物鼻内接种微生物以制作慢阻肺急性加重模型，其中Asakura等[12]在小鼠气管内注射5U PPE，4周后鼻内接种肺炎球菌以造模；Zhao等[13]将大鼠慢性暴露于CS中联合多次鼻内滴注肺炎克雷伯氏菌悬浮液造模；Sharan等[14]将小鼠暴露于CS中12周，然后使用非分型流感嗜血杆菌(non-typeable Haemophilus influenzae, NTHi)攻击小鼠，并通过测量肺功能、肺组织、BALF对加重模型进行评价；Bucher等[15]将小鼠暴露于CS中9 d后鼻内接种H1N1流感病毒；Jang等[16]将食蟹猴暴露于CS中4周后鼻内滴注H3N2病毒造模；Harada等[17]采用在小鼠气管内单次滴注PPE，12 d后鼻内接种H1N1型流感病毒，并在4 d后鼻内接种肺炎链球菌以模拟慢阻肺患者继发性细菌性肺炎。

5项研究采用PPE联合LPS造模，既有多次PPE及LPS暴露制作慢阻肺模型[18]，又有多次气管内滴注PPE造模后，通过单次气管内滴注LPS以制作慢阻肺急性加重模型[19]。有3项研究采用将小鼠慢性暴露于CS中联合多次腹腔注射CSE造模。有2项研究通过将小鼠或大鼠暴露于CS中并多次在气管内滴注PM2.5混悬液以研究急性PM2.5暴露造成的肺损伤。Rodrigues等[20]的研究采用将小鼠全身暴露于CS中60 d联合前30 d鼻内滴注PPE诱导慢阻肺模型并对模型进行肺功能及肺组织病理学评价。1项研究采用多次气管内滴注LPS及CSE制作慢阻肺动物模型[21]。1项研究采用气管内单次滴注LPS后将小鼠慢性暴露于MVE中造模，并通过肺功能、肺组织、BALF对此种模型进行评估[22]。

以上为PubMed数据库收录的2016年9月至2019年9月有关慢阻肺造模研究涉及的慢阻肺造模动物及造模方法的简单介绍，需要注意的是以上仅为慢阻肺造模相关文献的部分，并不能完全概括慢阻肺所有的造模方法。

2 慢阻肺实验动物的选择

构建慢阻肺动物模型的动物种类有啮齿类动物(小鼠，大鼠，豚鼠等)、哺乳动物(兔、犬、猪、猴等)，最常用的是小鼠和大鼠。

2.1 啮齿类动物

啮齿类动物作为最常用的种类有如下优势：①繁殖周期短、数量多，造模成本低；②体型小，便于进行实验；③检验检查设备、试剂等较全面；④基因组序列研究深入。但也存在以下不足：①肺部解剖与人类有差异，如没有明确的呼吸性细支气管，无法形成小叶中央型肺气肿[23]，支气管中无杯状细胞；②诊断方式与人类不同，人类慢阻肺诊断以肺功能为金标准，但啮齿类动物进行肺功能评价困难，大多通过肺病理组织学判断炎症细胞浸润及肺气肿程度；③体型小，血液及肺组织连续取材受限；④不同品系造模损害程度有差异，Harada等[24]研究表明BALB/cJ小鼠较C57BL/6J小鼠对外源性蛋白酶刺激更敏感，具体表现为肺功能下降更显著，肺组织炎症细胞更多，死亡率更高等。

啮齿类动物中小鼠最为常用。大鼠相对而言更不容易因CS暴露造成肺气肿样损伤[25]。豚鼠解剖学、生理及烟雾暴露后病理反应，包括炎症、肺气肿、小气道重塑及肺功能改变与人类相似[26]，而且豚鼠造模后粘液高分泌和肺气肿表现更突出，更适合进行肺部疾病研究[27]，但豚鼠具有使用成本高，体温调节能力差，缺乏人类免疫抗体等工具，难以进行分子研究[28]等不足，这限制了豚鼠在实际研究中的应用。

2.2 其他动物

兔、犬、猪、猴等哺乳动物也可用于慢阻肺造模，虽然肺部组织病理等与人类更相似，但因其成本高，不便操作等，使用率较啮齿类动物少。如：Raju等[7]研究示：将雪貂仅鼻暴露于CS中6个月后，雪貂出现清晨自发性咳嗽及气道阻塞、慢性粘液高分泌及以气道为中心明显的细菌感染的病理特征，与大鼠、小鼠相比更加符合人类慢阻肺特征，但小气道阻力(即组织阻尼)并未见明显升高，这与人类慢阻肺病理特征并不相符，因此还需要进一步的研究。

关于性别对慢阻肺发病的影响方面，现有研究有相互矛盾之处。Tam等[29]研究显示暴露于6个月CS后，相较于雄性或卵巢切除小鼠，雌性小鼠的小气道壁重塑增加，并与远端气道阻力增加，抗氧化剂基因下调，氧化应激增加和TGF-β1活化有关，这些病变可以通过卵巢切除术来预防，实验表明长期暴露于CS中的雌性小鼠小气道病变与氧化应激、TGF-β1信号转导增加及雌性激素作用相关，雌激素受体拮抗作用可能在减少女性吸烟者的氧化应激中具有价值。而Shen等[30]研究显示与雌性SH和雄性WKY大鼠相比，雄性SH大鼠表现出更明显的细胞、炎症和结构变化，更易出现慢阻肺样病变，其研究认为雄性SH大鼠是研究慢阻肺的最佳啮齿动物模型。

3 慢阻肺动物模型的制备及评价

目前构建慢阻肺动物模型主要通过CS暴露，气管内或鼻内滴注LPS、PPE、基因修饰等单一或复合因素造模。模型评价主要测量参数为肺组织病理数据、肺部炎症细胞和炎症介质，少部分研究测量了肺功能、动脉血气分析、肺部影像学等。

3.1 有害气体暴露

除遗传因素外，吸烟、空气污染、职业性粉尘和化学物质、生物燃料烟雾等构成了慢阻肺发病最主要的环境因素[31]。常用来造模的有害气体包括：CS，NO2，臭氧，PM2.5，MVE等。

3.1.1 CS暴露

CS是公认的慢阻肺发病最相关的危险因素之一，CS暴露造模最接近人类患病的环境，因此CS是用来制作慢阻肺动物模型的最常用有害气体，CS中含有超过4500种化学品，包括多种高度活性的自由基，可诱发炎症和致癌反应[32]，暴露于CS引起或加重与氧化应激和炎症相关的多种肺部疾病，包括慢阻肺和肺癌[33]，但其致病分子机制仍知之甚少。暴露于CS导致小气道阻塞，这与支气管纤维化、炎症浸润和上皮-间质转化有关，进而导致气道重塑[34]，引起肺功能下降。气道重塑的特征在于气道壁结构的变化，包括平滑肌肥大、基底膜增厚、黏膜下纤维化、黏液细胞化生、上皮脱落和血管生成[35]。

CS暴露分为两种：全身暴露于充满CS的密闭容器内或通过管道使动物仅鼻吸入CS，目前CS暴露的剂量、时间等并没有统一标准，一般认为至少需要暴露在CS中3个月。Xia等[36]把小鼠暴露在总悬浮颗粒物(total particulate matter, TPM) 为500 mg/m3的CS中4周后，发现与对照组小鼠相比，CS暴露小鼠BALF中总细胞、单核细胞和中性粒细胞的数量增加，肺组织中白细胞介素 (interleukin, IL)-6和IL-8的mRNA水平和BALF上清液中IL-6和IL-8的分泌水平升高，肺组织病理示有小气道增厚和胶原沉积，使用整体体积描记法测量的气道高反应性(airway hyperresponsiveness，AHR)较对照组小鼠增高，表明暴露于CS 4周即会引起肺部炎症和支气管上皮细胞损伤，进而影响气道重塑，导致肺功能障碍。

Drummond等[37]的研究表明：母体产前(交配前2周直至分娩)和小鼠成年前(出生后21～49 d)的CS暴露对成年早期的肺功能下降具有协同作用，这与产前肺发育受损是导致成年期慢阻肺的肺功能加速下降的危险因素假说相一致，但协同作用似乎不是由产前或青春期CS暴露对早期肺衰老的影响所介导的，生命早期阶段与气道上皮细胞分化和肺泡形成有关的分子机制还需要进行进一步研究。Polverino等[38]研究显示：CS暴露24周小鼠的肺和肾内皮细胞(endothelial cell, EC)损伤与肺和肾中组织氧化应激-高级糖化终末产物(advanced glycation end products, AGEs) -高级糖化终末产物受体(receptor for AGEs, RAGE) -内皮损伤途径的增加有关。还有研究表明CS 暴露对骨[39]和骨骼肌[40]也会产生一定负面影响。

3.1.2 臭氧

CS诱导的模型产生持续的气流限制，肺实质破坏，但CS模型耗时较久。除了吸烟，空气污染和职业暴露也是慢阻肺发病常见的原因，臭氧作为主要污染物之一，可直接与呼吸道发生反应，损伤肺组织，因此也有部分研究选用臭氧造模。Sun等[41]将小鼠全身暴露在浓度为2.5 ppm臭氧中，每次3 h，每周2次，持续7周，可以观察到小鼠出现类似于慢阻肺患者的用力呼气量减少，肺泡扩大，肺实质破坏，易疲劳，活动距离减少，炎症增加。

3.1.3 NO2

3.2 PPE

CS暴露虽然被认为是最符合人类慢阻肺发展的模型，但其存在造模时间长，肺泡扩大程度较轻[44]，停止烟雾暴露后病情停止进展，这与人类停止吸烟后慢阻肺情况依旧进展[45]不相吻合，因此蛋白酶作为一种替代方法，在发现人类α1-抗胰蛋白酶缺乏症和慢阻肺之间的关联后应运而生[46]，目前认为肺中蛋白酶和抗蛋白酶之间的失衡与慢阻肺形成有关。在模型动物气管内或鼻内灌注弹性蛋白酶，如木瓜蛋白酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶和PPE，可诱导肺气肿形成[46-47]，其中PPE较为常用。虽然这与人类慢阻肺病因不同，但可以导致模型动物产生持续性肺气肿，且肺气肿的程度在单个蛋白酶滴注后逐渐恶化，提示蛋白酶诱导的急性损伤触发的宿主内源性反应有助于渐进性肺气肿形成[48]。

Lan等[49]研究显示，小鼠气管内滴注PPE(用量为1.5 mg/kg，溶解在50 μL无菌磷酸缓冲盐溶液中)后，相较于对照组小鼠，实验组小鼠出现类似于人类的肺组织平均线性截距长度显著增加，肺部炎症浸润及胶原沉积。Dharwal等[50]研究显示，气管内滴注 1 U PPE后7 d，小鼠炎症反应最强烈，21 d肺气肿病变最显著。Shibata等[48]研究显示：鼻内滴注0.6 U PPE后，小鼠肺浸润性嗜碱性粒细胞分泌的IL-4促进肺浸润性单核细胞分化为产生致病性基质金属蛋白酶(metalloproteinase，MMP)-12的间质巨噬细胞，导致肺气肿形成，这仅可在肺气肿早期病变中发现，从而证明了之前未被重视的嗜碱性粒细胞、IL-4和间质巨噬细胞在肺气肿的发展中的作用。

3.3 LPS

LPS是革兰阴性菌细胞壁外膜中的重要成分，进入机体后可以刺激单核细胞、中性粒细胞等产生肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor, TNF)、IL -1、IL-6、集落刺激因子、干扰素等多种炎症介质，使机体产生炎症反应，进而形成肺气肿[51]。Khedoe等[52]研究显示：通过第1、3天鼻内分别滴注10 μg大肠杆菌LPS诱导急性肺损伤，可导致小鼠BALF中性粒细胞浸润和全身IL-6水平升高，在每周两次鼻内滴注10 μg LPS，持续20周的慢性研究中，可诱导小鼠产生持续气道炎症和肺气肿，但相较于PPE诱导的肺气肿，LPS诱导的模型动物中肺泡组织损伤程度较轻。LPS诱导的肺气肿只是短时间内造成肺损伤，形成肺气肿样病变，但不会出现渐进性通气障碍，因此只能复制慢阻肺的部分特征[53]。

3.4 复合造模方法

慢阻肺常用的复合造模方法包括CS暴露联合LPS、PPE、CSE或PM2.5，LPS联合PPE、CSE或MVE等，及单一方法联合细菌或病毒接种诱发慢阻肺急性加重模型，内容可参照1.2.2部分。

4 小结

慢阻肺动物模型常选用大鼠和小鼠作为模型动物，少数研究使用豚鼠、犬、猪、猴等动物造模。常用造模诱导剂包括有害气体(如CS、LPS、PPE等)，这些诱导剂都可以使模型动物产生肺部炎症及肺气肿改变，但干预时间及具体表现有所差异。CS诱导与人类慢阻肺发病病因相似，暴露后造成实验动物肺部炎症(BALF中炎症细胞数增加，炎症因子分泌增多，肺组织中炎症因子水平升高)，气道重塑(小气道增厚和胶原沉积)，肺功能障碍(气道高反应性)等病变[36]，但CS存在暴露周期长，肺泡病变轻，停止暴露后病情进展中止等不足。PPE单次滴注即可引起模型动物产生肺部炎症及肺气肿改变，且肺气肿病变呈渐进性、持续性。LPS反复滴注亦可引起模型动物产生持续性气道炎症及肺气肿，肺泡损伤轻于PPE诱导模型动物，但PPE及LPS干预都存在与人类发病病因不同的不足。大部分研究采用单一诱导剂引起模型动物慢阻肺病变，近年来越来越多的研究使用多种因素联合造模，因为复合因素造模比单一方法造模更符合人类慢阻肺病理表现且常常可以缩短造模时间。

建立人体疾病动物模型，通过其与人类疾病的对比研究，可以深入探索疾病发病机制，寻找治疗靶点及作用通路，开发治疗药物等，对疾病研究意义重大。但动物与人类生理病理差异，诱导方法作用机制未明，动物模型评价尚未统一标准，这些因素都对慢阻肺动物模型的研究造成一定影响。良好的动物模型应该具有与人类相似的解剖、生理、病理特征，造模方法具有一定的规范，以便于重复再现，并且研究者可根据实验目的不同选择相应的模型动物及造模方法。因此未来对于慢阻肺的实验研究应着重于选择最适合的动物种类及品系，对造模方法及模型评价形成一定的标准，以便制作出最符合人类生理病理机制的动物模型。