实时荧光定量RT-PCR方法在登革热小鼠模型中的评估及应用

陈 倩，李 丹，佟 巍，蔡方舟，郭 智，鲍琳琳，王 卫

(北京协和医学院比较医学中心，中国医学科学院医学实验动物研究所，新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室，卫健委人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

目前国内尚未建立理想的重症登革热动物模型，缺乏指导性强、可靠稳定的病原学指标。文献报告指出病毒的定量检测可针对病毒颗粒、病毒抗原、病毒核酸等[1]。传统方法有病毒分离方法，常用细胞培养分离和乳鼠颅内接种分离等，该方法比较可靠，但操作繁琐，实验周期长，不利于登革病毒的快速诊断。其次是抗原检测方法，酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析法(GICA)和免疫荧光法(IFA)等。但抗原检测方法操作繁琐，检测灵敏度较低，易与其他黄病毒发生交叉反应，产生假阳性[2-3]。在过去的几十年，分子诊断技术不断进步，使得检测和鉴定各种病原体更加可靠。其中实时荧光定量PCR方法逐渐成为病毒快速诊断的新的金标准。本研究对现有登革病毒RT-PCR检测方法进行优化，创建一步法实时荧光定量RT-PCR方法，并用于登革病毒感染小鼠模型的评估。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

2日龄SPF级BALB/c雄性乳鼠20只，体重2～3 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0008]，用于登革病毒的扩增。4～6周清洁级C57BL/6背景的I型干扰素受体敲除小鼠(Ifnar1-/-)[SCXK(京)2014-0011]，雌雄各半，共计40只，体重18～22 g，由中国医学科学院医学实验动物研究所北方中心提供，用于登革热小鼠模型制备。动物实验方案得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用和管里委员会的批准(WW18002)。动物饲养与实验均在中国医学科学院医学实验动物研究所生物安全二级动物实验室(ABSL-2)，遵照3R原则进行。

1.1.2 病毒株

登革病毒(DENV)：I型(TH-Sman株)、II型(New Guinea株/NGC适应株/TH-36株)、III型(TH87株)、IV型(H241株)均购自ATCC，本课题组保存。特异性分析所用病毒株包括：肠道病毒71型EV71(MP10株)、柯萨奇病毒10型CA10(SJZK12-0046T株)、柯萨奇病毒16型CA16(Shzh05-1株)、鼠肺炎病毒PVM(15株)、鼠肝炎病毒MHV(A59株)、呼肠孤病毒REO(Abney株)、鼠诺如病毒MNV(CW1株)、及狂犬病毒RV(CVS株)分别由中国医学科学院医学实验动物研究所肠道病毒课题组、检测中心及本课题组提供。

1.2 主要试剂与仪器

RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit: 52904)和实时荧光定量PCR试剂盒(Probe RT-PCR Kit: 204443)均购自德国Qiagen公司；Applied Biosystems 7500实时荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher公司。

1.3 实验方法

1.3.1 引物和探针

根据文献[4]，选择特异引物和TaqMan探针，上下游引物及探针序列分别为：5’-GAR AGA CCA GAG ATC CTG CTG TCT-3’; 5’-ACC ATT CCA TTT TCT GGC GTT-3’; 5’-FAM-AGC ATC ATT CCA GGC AC-MGB-3’，委托中美泰和公司合成。

1.3.2 标准品的制备

选择II型登革病毒(New Guinea株) 3’ UTR的目的片段制备标准品。使用上述特异性引物进行PCR扩增，将目的基因克隆于TOPO载体，构建质粒作为标准品，以上操作委托中美泰和公司完成。质粒合成后，用紫外分光光度计测定原倍标准品，质粒浓度为1035 ng/μL。

1.3.3 动物感染和取材

为扩增登革病毒，使用1 mL胰岛注射器(BD: 328421)吸取20 μL New Guinea病毒液，颅内接种2日龄BALB/c乳鼠(病毒浓度：8×105Copies/μL)。观察8～9 d，出现麻痹、抽搐瘫痪等中枢神经系统症状，则安乐处死动物。采取鼠脑，研磨；3500 r/min离心15 min，吸取上清冻存于-80℃冰箱。为建立小鼠模型，使用1 mL胰岛注射器吸取100 μL New Guinea病毒液，尾静脉接种Ifnar1-/-小鼠(病毒浓度：8×106Copies/μL)。在感染后第4天(4 Days Postinfection, Dpi.4)采取组织样本，直接冻存于-80℃冰箱；Dpi.2、4、6、8采取血液样本，3000 r/min离心10 min，吸取上清冻存于-80℃冰箱。

1.3.4 病毒核酸的提取

本实验操作在生物安全二级实验室(BSL-2)的生物安全柜内进行，操作步骤参见试剂盒说明书。简单地，1.5 mL EP管内预置560 μL病毒裂解液，加入140 μL样本；静置10 min，充分裂解。再加560 μL无水乙醇，混匀；转移至2 mL收集柱内，8000 r/min；加500 μL AW1，8000 r/min；加500 μL AW2，14000 r/min；空离14000 r/min；换新的1.5 mL EP管；加40 μL AVE，8000 r/min；重复上一步骤。4℃保存继续下一步实验，或冻存于-80℃冰箱。

1.3.5 一步法实时荧光定量PCR反应

根据表1，配制实时荧光定量PCR反应体系；根据表2，设定反应程序，共40个循环。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应程序

1.4 统计学方法

实验中得到的数据使用SPSS统计软件进行统计分析，NGC株与NGC适应株感染的小鼠样本重复三次检测，计算各组数据Ct值的标准差(Standard deviation, SD)和变异系数(Coefficient of Variation, CV)[5]。

2 结果

2.1 一步法实时荧光定量PCR方法的确定

在获得质粒标准品之后，使用分光光度计测定，测得质粒原液DNA浓度为1035 ng/μL。根据计算公式：质粒拷贝数(Copies/μL)=6.02×1023(Copies/mol)×质粒浓度(g/μL)/质粒分子量(g/mol)[6]；原倍质粒拷贝数为4.96×1011Copies/μL，连续十倍稀释，做6个稀释度，分别使用102～107倍稀释的标准品作为模板进行qRT-PCR，建立扩增曲线(图1)和标准曲线(图2)。图1中1～6为不同的稀释度，分别为4.96×104～ 4.96×109Copies/μL，可见各梯度间隔得临界循环数(threshold cycle, Ct)基本相等，约3个循环左右；以II型登革病毒标准品稀释拷贝数的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标建立实时荧光定量PCR的标准曲线。由标准曲线得出扩增效率为95.8%，相关系数R2=0.999，表明该PCR方法扩增效率较高，线性关系良好。

2.2 荧光定量PCR方法的评估

2.2.1 灵敏性分析

为了解该PCR方法的灵敏性，将II型登革病毒标准品进行十倍连续稀释(4.96～49.6×1010Copies/μL)，分别进行PCR检测。结果表明：浓度为4.96×101～4.96×1010Copies/μL的标准品都能产生扩增曲线，而4.96 Copies/μL的标准品未能检测到荧光信号(见图3)。由此可知4.96×101～4.96×1010Copies/μL为该方法可以检测到的线性范围，最低检测线为49.6 Copies/μL，灵敏性较好。

2.2.2 特异性分析

为了解该PCR检测方法的特异性，使用该PCR方法分别检测多种实验小鼠或小鼠模型常见病毒，包括四种血清型的登革病毒(I型TH-Sman株；II型New Guinea株/TH-36株；III型TH87株；IV型H241株)、肠道病毒(EV71、CA10、CA16)、PVM、PHV、REO、MNV及RV。结果显示：只有Ⅰ～Ⅲ型登革病毒(TH-Sman株、New Guinea株/TH-36株、TH87株)产生了扩增曲线，其余病毒均未检测到荧光信号(见图4)，说明无交叉反应，与预想一致，表明该PCR方法特异性良好。

2.2.3 稳定性分析

为了解该PCR方法的稳定性，本研究使用登革热小鼠模型常用的Ⅱ型登革病毒(New Guinea株及NGC适应株)来进行测试。分别将两株登革病毒十倍连续稀释，共6个梯度，经PCR检测，实验重复三次，结果见表3。结果显示：每个稀释度样本Ct值的标准差均小于0.5，且CV值均小于5%，表明该方法重复性好，稳定可靠。

图1 标准品的扩增曲线Figure 1 Amplification curve of the standard

图2 标准曲线Figure 2 Standard curve

图3 荧光定量PCR方法的灵敏性Figure 3 Sensitivity of the fluorescence quantitative PCR method

2.3 DENV RT-PCR方法的初步应用

为确定该PCR方法在登革热动物模型研究中的实际使用效果，使用Ⅱ型登革病毒New Guinea株和N10株分别感染I型干扰素受体敲除小鼠 (Ifnar1-/-)，获得感染后不同天数的血清样本及感染后第4天的组织样本。经实时荧光定量PCR检测，测得小鼠体内病毒载量的水平与分布。由图5可知：New Guinea株感染Ifnar1-/-小鼠，血清样本中病毒载量水平在感染后第2天达到高峰，在感染后第8天消失。由图6可知：登革病毒感染小鼠后，病毒主要分布在小肠、脾、肝、肾和脑。在感染后第4天，不同组织中病毒载量水平具有差异。New Guinea株感染小鼠在肠、肾、肝组织中未见明显病毒载量，NGC适应株感染小鼠在肠、脾、肾组织中可检测到高水平的病毒核酸，表明了两株登革病毒在小鼠体内的播散和分布情况。本方法使用于登革热小鼠模型的不同组织样本，多数可检测到荧光信号，Ct值主要介于26～31之间，检出率良好，表明本检测方法可应用于登革热小鼠模型的病毒定量检测。

图4 荧光定量PCR方法的特异性Figure 4 Specificity of fluorescence quantitative PCR method

表3荧光定量PCR方法的稳定性

Table3Repeatability of the fluorescence quantitative PCR method

稀释度DilutionCt值1Ct value 1Ct值2Ct value 2Ct值3Ct value 3平均值Mean标准差Standard deviation变异系数Variable coefficientNGC适应株Adapted strainNGC株StrainNGC适应株Adapted strainNGC株StrainNGC适应株Adapted strainNGC株StrainNGC适应株Adapted strainNGC株StrainNGC适应株Adapted strainNGC株StrainNGC适应株Adapted strainNGC株Strain10017.516.517.616.717.716.517.616.50.1050.1360.59%0.81%10-119.919.819.518.819.719.419.719.30.1960.4870.99%2.51%10-222.223.322.322.722.822.322.522.80.3050.4801.35%2.10%10-326.626.526.126.425.726.326.126.40.4100.0751.57%0.28%10-430.230.729.630.430.029.829.930.30.3230.4601.08%1.51%10-534.634.434.332.834.334.134.433.80.1620.8600.47%2.50%

图5 II型登革病毒感染I型干扰素受体敲除小鼠血清样本中病毒载量Figure 5 Viral load in serum samples from Ifnar1-/-mice infected with dengue virus type II

图6 II型登革病毒感染I型干扰素受体敲除小鼠组织样本中病毒载量Figure 6 Viral load in tissue samples from Ifnar1-/-mice infected with type II dengue virus

3 讨论

登革热和严重登革热是由登革病毒感染引起的传染性疾病，已成为全球性的严重公共卫生问题，目前仍缺少针对该疾病安全有效的药物和疫苗[7-8]。合适的动物模型是登革热防治产品和策略研究的重要工具[9]。荧光定量PCR方法是感染性模型检测常用的实验方法。本研究旨在评估可应用于登革病毒感染动物模型检测的一步法实时荧光定量PCR方法，从而为登革热小鼠模型的建立提供基础方法，推动疫苗和药物的研发进程。

登革热的分子诊断逐渐取代传统的病毒分离方法，成为病毒检测的金标准[10-11]。在过去十几年中，已经报道了多种基于RT-PCR的方法，主要针对NS1、NS5、3’UTR等基因序列[12-14]。Lanciotti等人[15]最初报道了两步嵌套式逆转录PCR，后经Harris等[16]改进为一步多重逆转录PCR用于登革病毒的检测和分型。但使用琼脂糖凝胶电泳分析扩增子大小区分四种血清型的登革病毒，灵敏度较低。Shu等[17]建立的血清型特异的一步法SYBR Green I实时荧光定量PCR方法，可以用于登革病毒感染急性期的检测与分型。但由于该染料可非特异性的结合DNA双链，因而假阳性信号产生的机率增加[4, 17-18]。Klungthong等[19]使用泰国收集的16454例登革热患者阳性血清，提高登革病毒检测的巢式PCR的灵敏度，但该方法需两次扩增步骤，操作相对繁琐。Sasmono等[10, 20]新建立了Simplexa Dengue 检测方法，提高了检测的灵敏度。但是，目前登革病毒的分子检测方法主要应用于临床样本，针对登革热动物模型的检测方法较少。

本研究改进并评估检测登革病毒的一步法实时荧光定量PCR方法，应用于登革热小鼠模型中。相对于普通的荧光定量PCR方法，本检测方法具有以下几个特点。一是使用了新型MGB探针，该探针与一般的TaqMan探针相比具有多种优势。首先，MGB探针在3’端采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，取代了常规可发光的荧光标记，大大降低反应的本底信号强度，提高反应的灵敏度。其次，MGB探针比一般探针的Tm值高，约10℃左右，增强反应的特异性[12]。二是简化了操作步骤，缩短了检测时间。常规实时荧光定量PCR检测需要进行逆转录及荧光定量两个步骤，所需4～6 h不等；而本检测方法通过使用一步法，只需约2 h便可得出结果。三是针对特定的病毒基因型。根据病毒包膜蛋白E的抗原性不同，登革病毒分为Ⅰ～Ⅳ个血清型。其中Ⅳ型登革病毒的遗传偏差较大，与Ⅰ～Ⅲ型存在较大的遗传差异性(33%)[21]。而我们建立的动物模型主要针对Ⅰ～Ⅲ型登革病毒，因此，本方法选择的引物和探针也是针对Ⅰ～Ⅲ型登革病毒。

本研究使用的登革病毒检测方法具有灵敏度高、特异性强、稳定性高等优点。通过对Ⅱ型登革病毒不同稀释度的标准品进行检测，最低限度达49.6 Copies/μL，灵敏度较好。同时，对4种血清型的登革病毒和多种实验小鼠、小鼠模型常见病毒进行检验，仅登革病毒产生扩增曲线，而EV71、CA10、CA16等其他9株RNA病毒检测结果均呈阴性，表明特异性好。使用12份乳鼠脑组织样品重复测定3次，标准差均小于0.5，变异系数小于5%，表明本方法可重复性高。

登革热小鼠模型的建立及登革病毒检测对于登革热发病机理、药物和疫苗研究具有重要意义[22]。第一代登革热小鼠模型使用高剂量登革病毒，以颅内注射的方式感染免疫健全小鼠，出现了在登革热患者身上并未观察到的神经症状，如四肢瘫痪、麻痹等。第二代模型使用登革病毒感染缺乏干扰素受体的免疫缺陷小鼠，如AG129小鼠等，该模型可模拟部分人类登革热症状，但不适于研究宿主的免疫应答[23]。在最近的工作中，研究者期望建立登革病毒的小鼠适应株，以低剂量病毒感染小鼠，使其不产生神经症状，更好的模拟人类登革热的临床表现，从而为后续研究奠定基础。本研究将检测登革热患者临床样本的实时荧光定量PCR方法改善、评估后，应用于登革热小鼠模型的病毒载量检测中。通过对40份不同的小鼠组织样本，如小肠、肝脏、脾脏等和40份血清样本进行定量检测，结果显示 Ifnar1-/-小鼠样品中登革病毒均呈阳性，且病毒载量水平具有差异。表明本检测方法适用于小鼠模型，登革病毒感染后不同时期及不同样本中的检验，检出率良好。值得注意的是，本检测方法用于登革热动物模型，需要明确具体检测时间及待检组织，现有模型样品在病毒感染8 d之后，无法检测到阳性结果；还需明确动物种类及用途等，本研究使用一型干扰素受体敲除小鼠(Ifnar1-/-)，如本方法应用于其他物种模型还需要进行预试，避免假阳性和假阴性的出现。

总之，本研究确认并评估了一种针对登革病毒的qRT-PCR方法，该方法可特异、灵敏、稳定地检测登革病毒，适用于登革病毒感染动物模型的建立和应用工作中，从而促进登革热发病机制研究及支撑药物疫苗研发。