D-半乳糖增加树鼩肠道IL-18的表达及肠道菌群失调

郭玉倩，陆姜利，角建林，曾跃勤，梁 张*，郑 红*

(1.昆明医科大学实验动物学部，昆明 650500； 2.昆明医科大学技术转移中心，昆明 650031； 3.昆明医科大学分子临床研究，昆明 650500)

越来越多的研究表明肠道菌群失调与肠道炎症的有密切联系。肠道菌群的多样性及丰度处于平衡状态时，能维持宿主正常的营养物质转化、能量代谢、免疫功能、神经生理功能等[1-2]。肠道微生物能激活树突状细胞表面的Toll样受体(TLRs)，导致IL-10、IL-12的分泌，进而诱导Th0分化为Th1、Th2。但肠道微生物引起肠道炎症的具体机制尚需进一步阐明[3-4]。

D-半乳糖在机体内聚集，会导致活性氧类(ROS)的蓄积与激活，诱导IL-1β、IL-6等多种细胞因子的表达，引起结肠炎性细胞浸润。但是D-半乳糖介导的肠道炎症反应是否与肠道菌群有关，未见报道。白细胞介素-18(IL-18)是一种强力致炎性细胞因子，参与肠道免疫系统调节。有报道称，IL-18的分泌与肠道菌群关系密切[5]。因此，本实验通过分析D-半乳糖作用下，新型实验动物树鼩回肠、盲肠、结肠组织IL-18的表达和内容物菌群的变化情况，初步探索肠道炎症反应与菌群微生态失调的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物

普通级中国树鼩滇西亚种10只，雄性，130～150 g，10月龄，购于昆明医科大学实验动物学部[SCXK (滇) K2015-0005]，饲养于昆明医科大学普通级实验室[SYXK (滇) K2015-0002]。饲料配方参照本课题组前期研究[6]。实验程序符合昆明医科大学动物实验伦理委员会要求(伦理审批号：KMMU2018022)，按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

D-半乳糖(Sigma-G5388，美国)；基因提取试剂盒(Omega，瑞士)；测序试剂盒(Hiseq Rapid SBS Kit v2，ThermoFisher，美国)；荧光计(Qubit 2.0，ThermoFisher，美国)；PCR 仪(Applied Biosystems® Gene Amp® PCR System 9700，美国)；免疫组化检测抗体IL-18(ab243091，abcam公司，英国)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物给药及处理

树鼩分为正常组和D半乳糖组(n=5)。每天下午2∶00，D-半乳糖组腹腔注射给药，给药量0.6 g/kg；正常组给予等量生理盐水。8周后，禁食12 h，心脏采血处死树鼩。距胃部约60～70 cm处，分离小肠的回肠(ileum，i)、大肠的盲肠(cecum，ca)和结肠(colon，co)，用生理盐水冲洗、收集肠内容物，储存于-80℃冰箱；肠组织浸泡于多聚甲醛中，4℃保存。

1.3.2 免疫组化分析

回肠、盲肠和结肠组织在多聚甲醛中固定48 h后，石蜡包埋。按照切片、烘烤、脱蜡、抗原修复、一抗孵育过夜、二抗孵育和DAB显色的流程操作，观察IL-18在两组树鼩不同肠段的表达情况。

1.3.3 PCR扩增、文库构建、测序及生物信息学分析

使用DNA试剂盒抽提DNA，合成带有Barcode的特异引物515F(5’-GTGYCAGCMGCC GCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，其中兼并碱基Y=C或T；M=A或C；H=A,C或T；V=A, C或G；W=A或T。对样本的16S rDNA V4区域进行扩增。文库构建、测序、生物信息学参考文献的方法进行[6]。统计分析在门、科水平上的物种组成及丰度。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 D-半乳糖作用下树鼩肠道3个部位IL-18表达增多

比较正常组(CT)和D-半乳糖组(D)树鼩回肠、盲肠和结肠中IL-18的表达，免疫组化染色(图1)显示，IL-18在D-半乳糖组肠黏膜细胞质呈棕黄色集中性表达，而在正常组基本无阳性表达。D-半乳糖组阳性细胞数和平均光密度值均显著性高于正常组(P<0.05)，提示D-半乳糖能够上调树鼩肠道3个部位IL-18的表达。

2.2 肠道菌群构成变化

正常树鼩肠道菌群中共发现24个门，以厚壁菌门(55.9%)、变形菌门(20.6%)、放线菌门(10.2%)和拟杆菌门(7.9%)为主(图2A)。D-半乳糖作用后，树鼩3个肠段共发现22个门，并且优势菌发生变化。变形菌门(42.9%)、厚壁菌门(36.8%)、拟杆菌门(11.8%)和放线菌门(5.6%)为优势菌群(图2B)。D-半乳糖组盲肠中变形菌门丰度升高(32.1±7.6)%与(13.0±6.6)%，P=0.03；结肠中放线菌门丰度减小(2.9±0.16)%与(10.7±3.7)%，P=0.02；回肠中疣微菌门丰度降低(0.1±0.02)%与(0.8±0.2)%，P=0.005。

使用热图分析科水平群落组成，选取丰度排名前50的科，纵坐标按照平均丰度由高到低进行排列(图3)。正常组(图3A)丰度最高的科依次是乳杆菌科(31.3%)、肠杆菌科(8.8%)、韦荣氏菌科(8.6%)和双歧杆菌科(8.1%)；而D-半乳糖组(图3B)肠杆菌科(27.8%)丰度最高，乳杆菌科(23.5%)、普雷沃氏菌科(8.3%)和伯克氏菌科(8.1%)丰度次之。在科层面，D-半乳糖组肠杆菌科和气单胞菌科丰度显著性升高，梭菌科、A4b科、双歧杆菌科和链孢囊菌科丰度显著性下降(表1)。

注：A：免疫组化显示IL-18的表达。B：阳性细胞数和平均光密度值统计分析，两组相比，**P<0.05。图1 IL-18在两组树鼩回肠、盲肠和结肠中的表达Note. A， Immunohistochemistry of IL-18 expression. B， The positive cell area and average optical density values were analyzed statistically.**P<0.05, compared between the two groups.Figure 1 Expression of IL-18 in the ileum, cecum, and colon of tree shrews in the two groups

注：A：正常组；B：D-半乳糖组。图2 门层面上Barplot聚类(各组均值)Note. A， Control group. B， D-galactose group.Figure 2 Clustering at the phylum level (mean of each group)

2.3 肠道菌群多样性分析

比较正常组和D-半乳糖组树鼩肠道菌群的Alpha多样性，计算Chao1指数和Shannon指数；分析Beta多样性的PCoA指数，发现两组树鼩3个肠段菌群的丰度(Chao1指数)和多样性(Shannon指数)和PCoA指数均没有显著性差异(P>0.05)(表2)。

注：A：正常组；B：D-半乳糖组。图3 科水平相对丰度热图(各组平均值)Note. A， Control group. B, D-Galactose group.Figure 3 Heatmap of relative abundance at the family level (mean of each group)

Table1Families with statistical differences in the same parts of the two groups

部位Parts菌群Flora组别Groups正常组Normal groupD- 半乳糖组D-galactose groupP值P value回肠Ileum 梭菌科Clostridiaceae 10.46%±0.18%0.10%±0.06%0.030盲肠Cecum 肠杆菌科EnterobacteriaceaeA4b科5.00%±1.80%5.20%±0.20%25.20%±6.80%3.50%±0.70%0.0080.015结肠Colon肠杆菌科Enterobacteriaceae双歧杆菌科Bifidobacteriaceae气单胞菌科Aeromonadaceae链孢囊菌科Streptosporangiaceae14.10%±5.40%8.90%±3.30%0.34%±0.08% 0.26%±0.0001%29.20%±7.60%1.90%±2.80%0.90%±0.30%0.13%±0.03%0.0490.0220.0240.001

表2 不同部位两组Alpha多样性和Beta多样性指数比较

3 讨论

众多证据表明，肠道微生物群失调导致机体功能异常和疾病发生，例如溃疡性肠炎[7]、腹泻型肠易激综合征[8]、慢性肾病[9]以及肠癌[10]等。D-半乳糖能引起结肠炎性细胞浸润，但是引起肠道炎症是否与肠道微生物群有关还未见报道。本研究选取菌群丰富的回肠、盲肠和结肠内容物，对树鼩肠道菌群16S rDNA V4区域进行高通量测序，构建正常树鼩与D-半乳糖作用下树鼩肠道3个部位微生物的基因图谱，并进行了生物信息学分析。探索D-半乳糖作用下树鼩肠道菌群与炎症因子IL-18的关系。

IL-18在肠中主要由活化的巨噬细胞和上皮细胞产生，属于Th1型致炎性细胞因子，能促进IL-1和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)产生，诱导Thl细胞产生干扰素-γ，促进TNF-α和多种趋化因子，在机体免疫损伤过程中发挥重要作用[11]。IL-18在溃疡性结肠炎小鼠结肠粘膜[12]表达升高。结肠炎性期间IL-18升高引发杯状细胞功能出现异常，进而引起粘液层的形成缺失，造成粘膜屏障破损，引发炎症[13]。本实验显示，D-半乳糖作用下树鼩回肠、盲肠和结肠粘膜IL-18的表达均明显升高，提示D-半乳糖引起树鼩肠道的炎症反应。

肠道菌群中厚壁菌门可将葡聚糖、肽聚糖[14]、糖原[15]等肠道内宿主无法消化的多糖类物质分解为可消化的小分子糖类, 促进宿主对营养物质的消化和吸收。有报道指出，短链脂肪酸是肠道菌群的主要代谢产物，大鼠肠道菌群失调，引起短链脂肪酸代谢障碍，进而影响短链脂肪酸受体(GPR43)的表达，从而导致血清中IL-18的表达升高[16]，与本研究结果相同。所以我们推测，本实验D-半乳糖导致树鼩肠道菌群紊乱，进而引发IL-18表达升高。

肠道中变形菌门丰度升高，其代谢产物脂多糖的产生增多，进而引起慢性代谢性内毒素血症，可导致肥胖、糖尿病和胰岛素抵抗发病率升高[17]。因此，变形菌门丰度升高，被认为是潜在的疾病诊断标志物以及肠道菌群紊乱的生物学标志物[18]。肠杆菌科(Enterobacteriaceae)可造成复杂腹腔内感染、急性肠胃炎、败血症等[19]。气单胞菌科(Aeromonadaceae)能够引起人和动物肠炎[20]，引发草鱼肠道炎性细胞浸润和肠绒毛融合肿胀[21]。双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)是肠道有益菌，能抑制病原菌繁殖，减少毒性代谢物产生。本实验发现，D-半乳糖作用下肠道菌群的结构发生显著改变，变形菌门(42.90%)上升为第1优势门。同时，树鼩盲肠和结肠的肠杆菌科丰度显著性升高，结肠中气单胞菌科显著性增加，双歧杆菌科丰度明显下降。提示D-半乳糖作用下，树鼩肠道通过增加致炎性细菌及其毒性代谢产物，刺激肠黏膜炎症因子IL-18的表达，继而诱发肠道炎症反应。

综上所述，在树鼩小肠区域回肠段、大肠的盲肠、结肠组织中，D-半乳糖增加了炎症因子IL-18表达和肠道菌群紊乱。由此推测，树鼩肠道菌群失调促进肠道炎症反应，本研究为树鼩作为肠道菌群动物模型提供了基础数据。